分离部分及其使用方法技术

本文提供了适合与多种治疗有效负载结合使用的分离部分。所述分离部分用于产生条件活性大分子，由此所述大分子具有降低的或最小的生物活性，直到所述分离部分在特定条件下被修饰。饰。饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离部分及其使用方法
[0001]本申请要求2019年5月14日提交的美国临时申请号62/847,914和2019年11月21日提交的美国临时申请号62/938,786的权益，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。
[0002]序列表
[0003]本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2020年5月14日创建的所述ASCII拷贝名为761146_000140_SL.txt且大小为896,815字节。

技术介绍

[0004]含有两个或更多个功能性多肽的重组融合蛋白在包括用于蛋白质纯化、成像、用作治疗剂以及药物递送在内的许多领域具有用途。例如，蛋白质药物可与抗体的Fc结构域或与载体蛋白(即人血清白蛋白)融合，以用于靶向、延长其血浆半衰期和/或实现治疗效果。Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357
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1369。
[0005]没有接头的功能性多肽或结构域的直接融合可导致许多不良结果，包括融合蛋白的错误折叠(Zhao等人,(2008),Protein Expr.Purif.,61:73
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77)、蛋白质生产的产量低(Amet等人,(2009),Pharm.Res.26:523
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528)或生物活性受损(Bai等人,(2006)Proc.Natl Acad.Sci.USA,102:7292
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7296)。克服这些困难的一种方法是在融合蛋白中的组分多肽或结构域之间使用接头序列。然而，选择合适的接头将蛋白质结构域连接在一起可为复杂的，并且在融合蛋白的设计中经常被忽略。Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357
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1369。接头序列的性质，如长度、疏水性、氨基酸组成、二级结构和整体折叠可影响接头的适用性，并且需要在设计和选择适当的接头时加以考虑。此外，可在选定条件下或在选定生物位置(例如，在肿瘤微环境中)裂解以递送活性治疗剂(例如，治疗性多肽)的接头可提供治疗剂的靶向药理学活性并减少不想要的全身作用。这给设计合适的接头带来了进一步的复杂性。
[0006]需要可用于制备稳定融合蛋白的改进的接头序列，包括可在选定条件下裂解的接头。因此，本文公开了新型分离部分或接头。可利用本文公开的分离部分或接头，例如将前药如条件活性和/或靶向细胞因子特异性地递送至靶位点，在所述靶位点所述接头被加工以激活生物活性。

技术实现思路

[0007]本文提供了产生和使用高效分离部分和/或接头的组合物和方法。接头可赋予与连接的一个或多个有效负载的生物活性有关的位点选择性。在一些实施方案中，分离部分和/或接头用于与治疗性蛋白质缀合以治疗疾病或病症，如增生性疾病、肿瘤性疾病、炎症性疾病、免疫学病症、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病等。
[0008]本文公开了包含分离部分的重组多肽，其中所述分离部分包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是酶、特别是蛋白酶的底物。所述蛋白酶可选自由以下组成的组：成纤维细胞激
活蛋白α(FAPα，也称为脯氨酰肽链内切酶FAP)，组织蛋白酶L(CTSL1)，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12 ADAM17和ADAMTS1的ADAM，以及选自MMP1、MMP2、MMP9或MMP14的MMP。所述可裂解部分也可以是组织蛋白酶的底物，所述组织蛋白酶如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶L。优选地，所述组织蛋白酶是组织蛋白酶L。优选地，所述蛋白酶是MMP14或组织蛋白酶L。所述可裂解部分可包含作为至少两种蛋白酶的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述分离部分包含两个或更多个可裂解部分，所述可裂解部分中的每一个是蛋白酶的底物。所述分离部分可包含第一可裂解部分，所述第一可裂解部分包含作为第一蛋白酶的底物的第一氨基酸序列；和第二可裂解部分，所述第二可裂解部分包含作为第二蛋白酶的底物的第二氨基酸序列。在实施方案中，本公开涉及包含分离部分的重组多肽，所述分离部分含有如本文公开的蛋白酶裂解基序。所述重组多肽可包含分离部分，所述分离部分包含选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195
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220具有至少90％同一性的氨基酸序列。优选的分离部分包含序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)。本公开还涉及包含SEQ IND NO:195
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220的分离部分的功能变体。SEQ ID NO:195的功能变体可包含SEQ ID NO:258
‑
331中的任一者。SEQ ID NO:198的功能变体可包含SEQ ID NO:198，包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:332
‑
408中的任一者。本文公开的分离部分可包含式I：[D1]‑
[L1]‑
[D2]。D1是第一目标结构域。L1是将D1连接(connect)或连结(link)至D2的分离部分，其中所述分离部分包含选自SEQ ID NO:195
‑
220的氨基酸序列或与SEQ ID NO:195
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220具有至少约90％同一性的氨基酸序列。D2是第二目标结构域。
[0009]在一个实施方案中，所述重组多肽还可包含不可裂解的接头序列。所述重组多肽可包括治疗性蛋白质，如细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、抗体的抗原结合部分(例如，scFV、dAb)等。在另一个实施方案中，所述重组多肽包括细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体或它们的任何组合。在另一个实施方案中，所述重组多肽包含细胞外结构、跨膜结构域和细胞内结构域中的至少一者。在一个实施方案中，所述重组多肽包含细胞表面受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)亚基。在一个实施方案中，所述重组多肽包括抗原结合多肽、抗体或其抗原结合部分。
[0010]在一个实施方案中，与参考多肽序列相比，所述可裂解部分通过一种或多种蛋白酶以(a)更高的催化效率或(b)更高的特异性或(c)(a)和(b)两者裂解。在另一个实施方案中，所述一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：FAPα，CTSL1，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12ADAM17和ADAMTS1的ADAM，以及选自MMP1、MMP2、MMP9和MMP14的MMP。所述一种或多种蛋白酶还可包括选自组织蛋白酶的蛋白酶，所述组织蛋白酶如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶L。在另一个实施方案中，参考多肽序列存在于FAPα，CTSL1，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12 ADAM17和ADA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的蛋白酶可裂解氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195
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220具有至少约90％同一性的氨基酸序列。2.一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:195、或SEQ ID NO:195或SEQ ID 198的功能变体、或SEQ ID NO:198的功能变体。3.如权利要求2所述的多肽，其中SEQ ID NO:195的所述功能变体包含SEQ ID NO:258
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331中的任一者。4.如权利要求2所述的多肽，其中SEQ ID NO:198的所述功能变体包含SEQ ID NO:199、或SEQ ID NO:332
‑
408中的任一者。5.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:195。6.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:198。7.一种多肽，所述多肽包含式I：[D1]
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[L1]
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[D2]，其中D1是第一目标结构域；L1是将D1连接或连结至D2的分离部分，其中所述分离部分包含选自SEQ ID NO:195
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220的氨基酸序列或与SEQ ID NO:195
‑
220具有至少约90％同一性的氨基酸序列；D2是第二目标结构域。8.如权利要求1或7所述的多肽，其中所述分离部分包含与选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的氨基酸序列或与选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的氨基酸序列至少至少90％同一的氨基酸序列相邻的至少一个脯氨酸残基。9.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述分离部分包含作为两种或更多种蛋白酶的底物的可裂解部分。10.如权利要求1
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9中任一项所述的多肽，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：FAPa，CTSL1，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12 ADAM17和ADAMTS1的ADAM，以及选自MMP1、MMP2、MMP9和MMP14的MMP。11.如权利要求1
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9中任一项所述的多肽，其中所述蛋白酶选自MMP1、MMP2、MMP9、MMP4、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K或组织蛋白酶L。12.如权利要求1
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7中任一项所述的多肽，其中所述分离部分包含作为存在于人肿瘤的肿瘤微环境中的至少一种蛋白酶的底物的氨基酸序列。13.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述分离部分包含两个或更多个可裂解部分，所述可裂解部分中的每一个是蛋白酶的底物。14.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，所述多肽包含第一可裂解部分，所述第一可裂解部分包含作为第一蛋白酶的底物的第一氨基酸序列；和第二可裂解部分，所述第二可裂解部分包含作为第二蛋白酶的底物的第二氨基酸序列。15.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，所述多肽还包含不可裂解的接头序列。16.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体或它们的任何组合。17.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的至少一者。
18.如权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含细胞表面受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)亚基。19.如权利要求权利要求1
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8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括抗原结合多肽、抗体或其抗原结合部分。20.如权利要求1
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14中任一项所述的多肽，其中与参考多肽序列相比，所述可裂解部分通过一种或多种蛋白酶以(a)更高的催化效率或(b)更高的特异性或(c)(a)和(b)两者裂解。21.如权利要求20所述的多肽，其中所述一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：FAPa，CTSL1，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12 ADAM17和ADAMTS1的ADAM，以及选自MMP1、MMP2、MMP9和MMP14的MMP。22.如权利要求21所述的多肽，其中所述蛋白酶选自MMP1、MMP2、MMP9、MMP4、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K或组织蛋白酶L。23.如权利要求21所述的多肽，其中所述参考多肽序列存在于FAPa，CTSL1，选自ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM12 ADAM17和ADAMTS1的ADAM，以及选自MMP1、MMP2、MMP9和MMP14的MMP，或它们的组合的天然存在的多肽底物中。24.如权利要求1
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23中任一项所述的多肽，其中与参考多肽序列相比，所述可裂解部分通过一种或多种蛋白酶以降低的催化效率裂解。25.如权利要求24所述的多肽，其中所述可裂解部分通过一种或多种血清蛋白酶以降低的催化效率裂解。26.如权利要求25所述的多肽，其中所述可裂解部分通过一种或多种肝蛋白酶以降低的催化效率裂解。27.如权利要求25所述的多肽，其中所述可裂解部分通过一种或多种因子Xa、丝氨酸蛋白酶或凝血酶以降低的催化效率裂解。28.如权利要求1
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25中任一项所述的多肽，其中所述多肽可操作地连接至选自由以下组成的组的部分：多肽部分、脂质部分、核酸部分、可检测部分和小分子。29.一种重组原蛋白，所述重组原蛋白包含：a.重组多肽，所述重组多肽包含作为蛋白酶的底物的可裂解部分，其中所述可裂解部分包含选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:195
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220组成的组的氨基酸序列至少至少90％同一的氨基酸序列；以及b.具有生物活性的多肽，其中所述原蛋白具有减弱的生物活性，并且其中所述蛋白酶对所述可裂解部分的裂解产生具有未减弱的生物活性的多肽。30.如权利要求29所述的重组原蛋白，其中所述具有生物活性的多肽包括细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体或它们的组合。31.如权利要求29所述的重组原蛋白，其中所述具有生物活性的多肽包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的至少一者。32.如权利要求29所述的重组原蛋白，其中所述具有生物活性的多肽包含细胞表面受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)亚基。33.如权利要求29所述的重组原蛋白，其中所述具有生物活性的多肽包括抗原结合多
肽、抗体或其抗原结合部分。34.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：a.信号传导蛋白或分子；和b.选自空间阻断部分、特异性阻断部分和它们的组合的阻断部分；以及c.包含如权利要求29中限定的可裂解部分的肽接头。35.如权利要求34所述的融合蛋白，其中(a)和(b)通过(c)可操作地连接。36.如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述肽接头包含同一可裂解部分的两个或更多个拷贝。37.如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述空间阻断部分包含人血清白蛋白(HSA)或抗HSA抗体。38.如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述信号传导蛋白是白细胞介素
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2氨基酸序列，所述白细胞介素
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2氨基酸序列包含：(i)非天然N末端和/或(ii)非天然C末端。39.如权利要求34所述的融合蛋白，其中所述信号传导蛋白是白细胞介素
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2氨基酸序列。40.如权利要求34所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含一个或多个也不是特异性阻断剂的半衰期延长结构域。41.如权利要求40所述的融合蛋白，其中所述非天然N和/或C末端是通过环状变换产生的。42.一种融合多肽，所述融合多肽包含通过蛋白酶可裂解接头连接至配体的第一多肽融合配偶体，其中所述可裂解接头已针对催化效率进行了优化，并且其中所述配体已任选地进行了修饰，其中所述第一多肽融合配偶体是阻断部分，所述阻断部分阻止所述经修饰的配体与靶受体或靶受体的亚基结合，直到所述蛋白酶可裂解接头裂解。43.一种融合多肽，所述融合多肽包含通过蛋白酶可裂解接头连接至配体的第一多肽融合配偶体，其中所述可裂解接头已针对催化效率进行了优化，并且其中所述配体已任选地进行了包括通过环状变换在内的修饰，以产生与天然配体相比非天然的N
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末端和新的C
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末端，并且其中所述经修饰配体的所述新的N
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末端或所述新的C
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末端中的至少一者可操作地连接至第一多肽融合配偶体以形成融合多肽，其中所述第一多肽融合配偶体是阻断部分，所述阻断部分阻止所述经修饰的配体与靶受体或靶受体的亚基结合，直到所述蛋白酶可裂解接头裂解。44.如权利要求42或43所述的融合多肽，其中所述第一多肽融合配偶体选自由以下组成的组：抗体、抗体片段和白蛋白分子。45.如权利要求42或43所述的融合多肽，所述融合多肽还包含含有第二阻断部分的第二多肽融合配偶体。46.如权利要求42或43所述的融合多肽，其中所述第二多肽融合配偶体是与所述第一多肽融合配偶体不同种类的阻断部分。47.如权利要求42或43所述的融合多肽，其中所述第一多肽融合配偶体是白蛋白，并且所述第二多肽融合配偶体是包含阻断细胞因子的活性的互补氨基酸序列的结构域。48.如权利要求42或43所述的融合多肽，其中所述第一多肽融合配偶体是空间阻断剂如白蛋白，并且所述第二多肽是特异性阻断剂，如细胞因子受体、细胞因子受体的一部分、
对细胞因子具有特异性的新形成亲和肽或特异性地结合所述融合多肽的细胞因子的抗体或抗体片段。49.如权利要求47所述的融合多肽，其中所述第二多肽融合配偶体是与所述第一多肽融合配偶体相同种类的阻断部分。50.如权利要求34、42或43中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含肿瘤抗原结合组分。51.如权利要求34、42或43中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽还包含血清半衰期延长结构域。52.如权利要求42或43所述的融合多肽，其中所述配体选自由以下组成的组：螺旋束蛋白和细胞因子(包括但不限于生长激素、IL
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2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：狼人治疗公司，
类型：发明
国别省市：