流感病毒疫苗及其用途制造技术

本文提供了组2流感血凝素茎部多肽，编码所述多肽的核酸，包含所述核酸的载体，以及包含所述多肽、核酸、载体的药物组合物，以及前述各项的使用方法，特别是在预防和/或治疗流感病毒感染中的使用方法。病毒感染中的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流感病毒疫苗及其用途
[0001]引言
[0002]本专利技术涉及医学领域。本文提供了甲型流感血凝素(HA)茎部结构域多肽，编码所述多肽的核酸，包含所述多肽、核酸的药物组合物，以及前述各项的使用方法。
[0003]本专利技术(至少部分)是根据由HHS授予的合同号HHSO100201700018C在政府支持下进行的。政府享有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0004]流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸道疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重程度范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有大约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。这些感染大多数可以归因于携带H1或H3血凝素亚型的甲型流感病毒，而乙型流感病毒的贡献较小，因此在季节性疫苗中通常包括这些病毒的代表。当前的免疫实践依赖于对流行的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸还在当前疫苗预防发病和死亡的失效中起作用。另外，由源自动物宿主并重配以增加人
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人传播的高毒力病毒株系引起大范围流行病的可能性也仍然对全球健康造成严重且现实的威胁。
[0005]流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些单链RNA区段编码11种不同的蛋白：一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)、两种基质蛋白(M1和M2)、三种非结构蛋白(NS1、NS2和PB1
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F2)以及两种外部糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。
[0006]甲型流感病毒在自然界中分布广泛，并且可以感染多种鸟类和哺乳动物。这些病毒是基于HA和NA蛋白的抗原结构的差异来分类的，其不同组合代表独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为特定流感病毒株系。虽然所有已知亚型都可以在鸟类中发现，但是当前流行的人甲型流感亚型是H1N1和H3N2。甲型流感病毒的系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要的所谓系统发育组：尤其是在系统发育组1(组1病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育组2(组2病毒)中的H3、H4和H7亚型。
[0007]乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内HA中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的谱系在人体中流行，以B/山形/16/88(也称为B/山形)和B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系为代表。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院治疗的严重疾病。
[0008]已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(HA)。血凝素或HA是一种三聚体糖蛋白，该三聚体糖蛋白锚定在病毒膜中并且具有双重功能：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒RNA释放到靶细胞的细胞
溶质中。HA包括较大的头部结构域和较小的茎部结构域。茎部结构域通过C
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末端跨膜结构域序列锚定在病毒膜中。该蛋白经翻译后切割，产生两个HA多肽：HA1和HA2(完整序列称为HA0)(图1A、图1B)。膜远端头部结构域主要源自HA1，而膜近端茎部结构域主要源自HA2。需要切割HA前体分子HA0来激活病毒的感染性，并且活化蛋白酶在宿主中的分布是流感病毒致病性的决定因素之一。哺乳动物和非致病性禽病毒的HA在细胞外切割，这限制了它们在宿主中向遇到适当蛋白酶的组织的扩散。另一方面，致病性病毒的HA被普遍存在的蛋白酶在细胞内切割，因此具有感染多种细胞类型并引起全身感染的能力。
[0009]季节性流感疫苗必须每年更新的原因是该病毒的变异性很大。在HA蛋白中，这种变异特别表现在头部结构域中，在头部结构域中，抗原性漂移和转变产生大量不同的变体。由于这也是免疫显性区域，因此大多数中和抗体都针对该结构域，并且这些抗体通过干扰受体结合而起作用。头部结构域的免疫显性和较大变异的组合解释了感染一个特定株系不会对其他株系产生免疫的原因：首次感染引发的抗体只能识别有限数量的与首次感染的病毒密切相关的株系。
[0010]近来，缺乏完整的流感血凝素球状头部结构域或其实质部分的流感血凝素茎部多肽已有描述，并且已经用于产生针对该茎部结构域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。据信，茎部多肽的表位的免疫原性低于球状头部结构域的高免疫原性区域，并且茎部多肽中不存在球状头部结构域可能允许发展针对茎部多肽的一个或多个表位的免疫应答(Steel等人，2010)。因此，Steel等人通过使A/波多黎各/8/1934(H1N1)和A/香港/1/1968(H3N2)株系的HA1结构域缺失氨基酸残基53至276，并通过用短的柔性连接序列GGGG替换该缺失序列，产生了流感HA茎部多肽。小鼠接种H3 HK68构建体并未产生与组1 HA交叉反应的抗血清。另外，如WO 2013/079473中所解释，茎部多肽是不稳定的并且未采取正确的构象，这一点已被以前显示能与全长野生型HA茎部区域的保守表位结合的抗体缺乏结合所证明。
[0011]Bommakanti等人(2010)描述了一种基于HA2的多肽，该多肽包含氨基酸残基330
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501(HA2)、7
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氨基酸接头(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基16
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55、6
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氨基酸接头GSAGSA，随后是HA1的残基290
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321，在HA1中具有突变V297T、I300E、Y302T和C305T。该设计基于H3 HA(A/香港/1/1968)的序列。该多肽仅针对H3亚型(A/Phil/2/82)内的另一种流感病毒株系而不针对H1亚型(A/PR/8/34)提供交叉保护作用。在Bommakanti等人(2012)的最新论文中，描述了基于来自H1N1 A/波多黎各/8/1934(H1HA0HA6)的HA的茎部多肽。在这种多肽中，氨基酸残基48至288的等效物已经缺失，并且产生了突变I297T、V300T、I302N、C305S、F392D、F395T和L402D。基于H3和H1两者的多肽均在大肠杆菌(E.coli)中表达，因此缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖。
[0012]Corbett等人(2019)已经描述了展示在自组装铁蛋白纳米颗粒上的甲型流感病毒H3和H7 HA茎部三聚体，这些三聚体在小鼠中引起保护性、同亚型抗体。尽管具有免疫原性，但与铁蛋白融合的HA抗原也可能诱导针对载体纳米颗粒的不需要的应答，这可能导致在重复免疫后HA定向的免疫应答及其寿命的降低。此外，HA
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铁蛋白融合蛋白的表达水平和纯化挑战可能会阻碍大量疫苗剂量的生产。而且，对靠近此类纳米颗粒表面的HA表位(诸如CR80本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含组2甲型流感病毒的血凝素(HA)的HA1结构域和HA2结构域的单体甲型流感HA茎部多肽，所述HA茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
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该HA1结构域中头部区域的缺失；
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该HA2结构域中三聚化区域的修饰；
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能够形成至少一个单体内半胱氨酸桥的至少两个半胱氨酸残基；并且其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是W，其中该HA茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是对应于参考株系H3N2 A/爱知/2/68(SEQ ID NO:1)的全长HA编号的H3编号。2.根据权利要求1所述的多肽，其中位置432处的氨基酸是I，或位置432处的氨基酸是I且位置380处的氨基酸是I。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中位置378处的氨基酸是T，位置379处的氨基酸是N和/或位置381处的氨基酸是V。4.根据权利要求1、2或3所述的多肽，该多肽进一步包含在位置401
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403处的引入的糖基化基序，用于位置401处的N
‑
连接的糖基化。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的多肽，其中该HA1结构域中头部区域的所述缺失包括至少包含从对应于位置50处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置302处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列的缺失。6.根据权利要求5所述的多肽，其中该HA1结构域中头部区域的缺失至少包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的多肽，其中该HA2结构域中的三聚化区域包含从对应于位置405处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置419处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该三聚化区域的修饰包括引入异源三聚化结构域。9.根据权利要求8所述的多肽，其中该异源三聚化结构域是GCN4序列。10.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的多肽，其中该三聚化区域的修饰包括改变C
‑
螺旋中的七肽重复序列。11.根据前述权利要求1
‑
9中任一项所述的多肽，其中该HA2结构域中的修饰的三聚化区域包含氨基酸序列
405
RMKQIEDKIEEIESK
419
(SEQ ID NO:9)或
405
PMKQIEDKIEEIESK
419
(SEQ ID NO:10)。12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包含在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置311的氨基酸处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置308的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置418的位置处的半胱氨酸的组合，其中所述半胱氨酸能够形成单体内半胱氨酸桥。13.根据权利要求12所述的多肽，该多肽包含在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合，其中所述半胱氨酸形成所述至少一个单体内半胱氨酸桥。14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中位置388处的氨基酸是M。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包含至少一个另外的引入的糖基化基序。16.根据权利要求15所述的多肽，其中该至少一个另外的引入的糖基化基序存在于位置392
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394处用于位置392处的N
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连接的糖基化和/或位置393
‑
395处用于位置393处的N
‑
连接的糖基化。17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B
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环中的一个或多个氨基酸突变成P。18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中：
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位置31处的氨基酸是E且位置34处的氨基酸是V；
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位置392处的氨基酸是S或P；
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位置395处的氨基酸是T或P；
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位置399处的氨基酸是S或P；
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位置435处的氨基酸是N或R；和/或
‑
位置439处的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：扬森疫苗与预防公司，
类型：发明
国别省市：