本发明专利技术提供一种异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用，该异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，该异源三聚体化结构域能够与不同来源的蛋白质融合形成异源三聚体化融合蛋白。实验表明，异源三聚体化融合蛋白能与某些对应的抗体相识别并有效地高滴度结合，也能作为抗原诱导产生高滴度的抗体。基于本发明专利技术所构建的技术平台，为诸如制备有效疫苗抗原防御疫病、制备功能性有效细胞因子治疗免疫系统疾病及针对某些癌症制备防御和治疗性疫苗、针对疫病检测监测制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂等设想提供了可行性的解决方法。提供了可行性的解决方法。提供了可行性的解决方法。
【技术实现步骤摘要】
异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用
[0001]本专利技术涉及生物工程及病毒疫苗
，尤其涉及一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备疫苗、制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用。
技术介绍
[0002]自然界中无论是复杂的高等生物如哺乳动物还是简单的低等生物如噬菌体和包膜病毒等都存在功能性的寡聚蛋白体，参与机体的机能运作。寡聚蛋白体，也叫多聚蛋白质或多亚基蛋白体，是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体。与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同，能产生变构效应以利于细胞识别，信号传导和功能调节等。例如人体的免疫系统是一个多细胞体系高度协调作用的系统，其中的信号传导途径中就涉及到细胞受体和细胞配体的相互识别、结合及触发信号传递通路的激活，引发免疫细胞的系列反应。在这个过程中，细胞膜上的受体及相对应的配体(如细胞因子)常常以寡聚蛋白多肽形式出现，例如同型二聚体或三聚体。它们的异常变化，都会引起机体功能出现异常，导致诸如内风湿关节炎、癌症等病变。
[0003]寡聚蛋白体的功能作用，在具囊膜的病毒尤其是RNA囊膜病毒家族中最具表现性，例如肺炎合胞病毒、流感病毒、新型冠状病毒等。这类病毒在侵入其宿主细胞时，首先靠其囊膜上的特殊糖蛋白与宿主细胞膜上的对应受体结合，引起细胞膜融合，进而将病毒遗传物质注入宿主细胞内，以便病毒的大量复制。病毒囊膜上的这种寡聚糖蛋白自然成为了疫苗研究中刺激免疫系统产生针对性有效中和抗体的主要靶标。然而，这种囊膜病毒尤其是RNA病毒囊膜上的寡聚糖蛋白有着其特殊的结构与功能。在病毒与宿主细胞融合前与融合后，病毒囊膜蛋白的空间构像发出了变化，从融合前的弱稳定构象变成了融合后的强稳定构象，但病毒囊膜蛋白融合前的形式含有不存在于融合后的形式上的抗原表位。就拿现在大流行的新型冠状病毒为例，病毒囊膜上的刺突S糖蛋白是以同源三聚体形式出现，其单体则由S1亚基和S2亚基共同构成，S1亚基含有与宿主细胞ACE2受体结合的区域RBD(Receptor Banding Domain)。当S1亚基中的RBD与宿主细胞ACE2结合后，引发S蛋白三聚体不稳定性变化，进而造成S1亚基和S2亚基发生解离。S2亚基的构象变为高度稳定的融合后结构，因此S蛋白具有融合前(Prefusion)和融合后(Postfusion)两种构象。在此变化过程中，S蛋白多肽处于囊膜最外端的带有免疫抗原决定簇结构部分的RBD移入到下面被遮盖，而非抗原决定簇部分则稳稳地暴露在外端。这种空间构像的变化，给疫苗的研制带来了挑战，因为免疫系统激发的强有力的保护性中和抗体需要与融合前的S蛋白三聚体反应。遗憾的是，用常规制备重组蛋白亚基作为疫苗抗原的方法只会产生融合后的强稳定构象的抗原蛋白，大大降低甚至失活了抗原的免疫原性，致使疫苗失去保护功效。正因为S蛋白的重要功能及构象易变的特性，获得性质稳定、构象均一的正确的S蛋白三聚体结构是成功开发疫苗、中和性抗体以及血清学检测试剂盒的关键因素，以便最大限度地刺激免疫系统产生正确的免疫应答
反应，当天然病毒真正来袭时这些中和性抗体将把病毒的S蛋白锁定在无法入侵细胞的形式，起到保护人体健康的作用。
[0004]多数寡聚蛋白体其结构上都有一共性，即蛋白单体的某一段多肽是构成及稳定蛋白体寡聚化构象的功能结构域，形成同源或异源二聚体、三聚体、四聚体等多聚蛋白体。鉴于此，本专利技术提供一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白，为诸如制备有效疫苗抗原防御疫病、制备功能性有效细胞因子治疗免疫系统疾病、针对某些癌症制备防御和治疗性疫苗及制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂等设想提供了可行性的解决方法。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术的上述不足，本专利技术提供了一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备疫苗、制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术第一个目的是提出一种异源三聚体化结构域，所述异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，定向突变后的异源三聚体化结构域中每条多肽的N端含有一个长形的a
‑
螺旋片段、C端含有一个反向平行的短形的a
‑
螺旋片段，这两个螺旋片段之间由一个柔性小环相连接。
[0008]进一步地，所述位点定向突变使长形a
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螺旋片段上引入2个S
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S共价键位点。
[0009]更进一步地，所述定向突变的位点分别是多肽片段的G29C和F30C。
[0010]更进一步地，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]更进一步地，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的突变体、SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的嵌合体。
[0012]进一步地，所述病毒囊膜糖蛋白来源于全部人流感病毒和动物流感病毒。
[0013]本专利技术的第二个目的是提出一种融合蛋白三聚体，所述三聚体的每个蛋白单体融合多肽包含：
[0014](1)其C
‑
端融合的上述任一项所述的异源三聚体化结构域多肽，
[0015](2)其C
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端与异源三聚体化结构域多肽之间插入的一个GSGGSG编码铰链。
[0016]本专利技术的第三个目的是提出一种异源三聚体化融合蛋白组合物，其包含三条多肽链，其中每条多肽链包含：
[0017](1)上述任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽，
[0018](2)与上述任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽的N
‑
末端连接的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽。
[0019]进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽来自于同源的分泌性蛋白。
[0020]进一步地，其特征在于，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽来自于非同源的分泌性蛋白。
[0021]进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽是预防用疫苗抗原蛋白多肽分子。
[0022]更进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽选自新冠病毒膜表面的刺突S蛋白多肽、流感病毒膜表面的血凝素蛋白HA多肽。
[0023]本专利技术的第四个目的是提出上述任一项所述异源三聚体化融合蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0024](1)对结构域多肽的G29C和F30C两个位点的D N A碱基进行PCR定点突变得到三聚体化结构域DNA片段；回收三聚体化结构域DNA片段，并将该DNA片段克隆至质粒载体，构建三聚体化结构域重组质粒；
[0025](2)将待三聚体化的非本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，定向突变后的异源三聚体化结构域中每条多肽的N端含有一个长形的a
‑
螺旋片段、C端含有一个反向平行的短形的a
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螺旋片段，这两个螺旋片段之间由一个柔性小环相连接。2.根据权利要求1所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述位点定向突变使长形a
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螺旋片段上引入2个S
‑
S共价键位点。3.根据权利要求2所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述定向突变的位点分别是多肽片段的G29C和F30C。4.根据权利要求3所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA序列如SEQ ID NO.6所示。5.根据权利要求4所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的突变体、SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的嵌合体。6.根据权利要求1所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述病毒囊膜糖蛋白来源于全部人流感病毒和动物流感病毒。7.一种融合蛋白三聚体，其特征在于，所述三聚体的每个蛋白单体融合多肽包含：(1)其C
‑
端融合的权利要求1
‑
6任一项所述的异源三聚体化结构域多肽，(2)其C
‑
端与异源三聚体化结构域多肽之间插入的一个GSGGSG编码铰链。8.一种异源三聚体化融合蛋白组合物，其特征在于，其包含三条多肽链，其中每条多肽链包含：(1)权利要求1
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6任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽，(2)与权利要求1
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6任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽的N
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末端连接的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽。9.根据权利要求8所述的一种异源三聚体化融合蛋白组合物，其特征在于，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽来自于同源的分泌性蛋白。10.根据权利要求8所述的一种异源三聚体化融合蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：许雁，诺曼吉利卡，李改，夏燕，邓爽，
申请(专利权)人：加拿大诺华生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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