ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用，属于疾病诊断及预后评级技术领域；ENO1基因启动子区甲基化位点如SEQ ID No.1所示，提取食管鳞癌和癌旁正常样本组织DNA，经亚硫酸氢盐修饰后采用飞行质谱法检测ENO1基因启动子区CpG位点的甲基化频率，同时采用免疫组化检测食管鳞癌和癌旁正常组织样本中ENO1蛋白的表达；研究发现食管鳞癌中ENO1基因启动子区低甲基化且ENO1蛋白高表达，且其低甲基化的患者预后不良，ENO1可促进食管癌细胞的糖酵解水平，促进其增殖并抑制凋亡；检测ENO1基因的甲基化水平用于食管鳞癌的早期诊断和预后评价的试剂。断和预后评价的试剂。断和预后评价的试剂。

【技术实现步骤摘要】
ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用


[0001]本专利技术属于疾病诊断及预后评级
，具体涉及ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]食管癌（Esophageal carcinoma，EC）是全球致死相关癌症中居第六位的肿瘤。食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌中最常见的组织学亚型，特别是在东亚，非洲东部和南部高发。在中国，约 90％的食管癌患者都为食管鳞状细胞癌。中国的食管癌有明显的地域分布，在河南、河北、江苏、陕西、山西、福建等地居各肿瘤中的发病率居首位。尽管诊断和治疗方法有所改善，但由于早期淋巴结转移，食管鳞癌晚期患者的生存率仍然很低，其患者5年生存率仍较低。根据病因学和流行病学研究表明，食管癌的发生是多种因素共同发挥效应而导致的疾病。因此，当下寻找导致食管癌的致病因素和发病机制尤为重要。
[0003]烯醇化酶 1（ENO1）作为糖酵解中的关键酶，可以催化 2
‑
磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸。ENO1除行使糖酵解中的催化功能外，还在许多转移性肿瘤中发挥重要作用。已有研究报道ENO1可以影响肿瘤细胞的增殖、细胞凋亡、侵袭和转移等生物学行为。例如，在结肠癌中，ENO1可以通过调节AMPK/mTOR通路促进结肠癌的增殖、侵袭和迁移能力。此外，沉默ENO1 的表达可通过抑制 PI3K/ Akt途径抑制神经胶质瘤细胞的生长，迁移和侵袭。在结直肠癌中，FBXW7通过蛋白酶体途径来促进ENO1的泛素化水平降解，以降低肿瘤的糖酵解水平，最终抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。另有研究报道ENO1高表达的患者总体生存率降低。
[0004]食管癌的发生是由环境和遗传因素共同作用引起的。DNA甲基化是人类基因组的主要表观遗传形式。在大多数类型的癌症中，DNA甲基化通常存在异常。甲基化是基因组 DNA中胞嘧啶的共价修饰，主要发生在脊椎动物的CpG二核苷酸中，并且通常与长期转录抑制相关。通过检索相关文献，发现在食管癌中，P16、RASSF1A基因的启动子区域均存在高甲基化状态，高甲基化抑制基因的表达，从而促进癌症的发展。申请人前期研究发现，食管鳞癌组织中miR
‑
203和miR
‑
34a甲基化水平明显高于癌旁正常组织，且它们的高甲基化和表达水平具有显著相关性，经分析还发现其高甲基化水平与淋巴结转移显著相关，表明其高甲基化水平促进食管鳞癌的发展。还发现，PLCE1基因启动子区低甲基化调控其蛋白高表达，并通过NFκB通路和VEGF
‑
C/Bcl
‑
2的表达促进食管鳞癌细胞的血管生成和增殖。因此，探索食管癌中基因的甲基化对于ESCC的早期诊断，精确预后和个体化治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术公开了一种ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试剂盒中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：
本专利技术的一个目的是提供ENO1基因启动子区甲基化位点，ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID No.1所示。
[0007]进一步地，甲基化区域为ENO1基因转录起始点上游5094bp~5355bp处，包括22个CpG位点；甲基化区域转录为RNA片段，经RNase A酶切得到12个CpG单位，经RNase A酶切得到的12个CpG单位分别为CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16、CpG_20、CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19 和CpG_21.22。其中CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16 和 CpG_20未检测到，成功检测剩余的CpG单位：CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19和CpG_21.22。
[0008]进一步地，CpG_9.10.11的甲基化频率作为诊断和诊断食管癌生存预后的生物标志物， CpG_9.10.11位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对，引物对为具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供所述引物对在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术的另一个目的是提供检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂盒中的应用；检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂为DNA Methylation
‑
Gold
™
。
[0012]本专利技术还有一个目的是提供一种检测ENO1表达量的试剂在制备诊断和/或预后评价食管癌的试剂或试剂盒中的应用；检测ENO1表达量的试剂为EZ
‑
96 DNA Methylation
‑
Gold
™
。
[0013]本专利技术的另一个目的是提供一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒，包括以上所述的引物对。
[0014]本专利技术的另一个目的是提供一种定量检测所述的ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的方法，包括以下步骤：1）提取食管鳞癌组织样本的基因组DNA；2）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA；3）以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，用上述的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；4）将PCR扩增产物依次进行虾碱性磷酸酶处理、转录和酶切反应、树脂纯化和甲基化质谱分析，得到样本的ENO1启动子区全部CpG位点甲基化水平。
[0015]进一步地，PCR扩增反应的体系为：DNA模板2.0μL，浓度为10pmol/μL 的正向引物0.2μL，浓度为10 pmol/μL的反向引物0.2μL，浓度为5U/μL的PCR Enzyme 0.2μL，反应终浓度为200μM的dNTPs 1.0μL，反应终浓度为1
×
的 10
×
PCR Buffer 1.0μL，ddH2O补足体积至10μL。
[0016]进一步地，PCR扩增反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；72℃延伸3min。
[0017]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的ENO1基因启动子区甲基化位点，甲基化区域如SEQ ID No.1所示。检测食管鳞癌组织中ENO1基因启动子区特定CpG位点呈低甲基化状态，而在癌旁正常组织细
胞中，ENO1基因启动子区特定CpG位点呈相对高甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对，其特征在于，所述引物对为具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。2.ENO1基因启动子区甲基化位点在制备诊断和诊断食管癌生存预后的生物标志物的应用，其特征在于，所述ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID No.1所示，作为诊断和诊断食管癌生存预后的生物标志物的ENO1基因启动子区甲基化位点为CpG_9.10.11位点，所述CpG_9.10.11位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。3.权利要求1所述引物对在制备早期诊断和/或预后评估食管癌的试剂或试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓宾，赵琳玥，王文洁，陈云昭，孙琦，丁友祥，禹洁，陈曦，李锋，韩雪萍，孟凡青，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：