含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物制造技术

本发明专利技术公开了含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物，包括BRD4抑制剂，且所述BRD4抑制剂为JQ1抑制剂，含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物的应用，所述钙化性主动脉瓣膜疾病为心脏瓣膜钙化病变。本发明专利技术发现沉默BRD4能抑制OM诱导瓣膜间质细胞成骨样分化，具有一定的临床转化意义，为钙化性主动脉瓣膜病的治疗提供新的潜在靶点和理论依据，特别是对钙化性主动脉瓣膜疾病药物的研发提供了基础。发提供了基础。发提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体为含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物。

技术介绍

[0002]心脏瓣膜钙化病变在组织学上是不可逆的，严重危害人类健康。瓣膜置换术是目前临床上治疗CHVD唯一有效的手段，但存在风险高、并发症多、后期满意度低等缺点。因此，预防和延缓CHVD的发生发展显得尤为重要。迄今为止，临床上未见有安全有效的药物用以预防和抑制瓣膜钙化。虽然他汀类药物和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂一直寄予厚望，但大量临床试验均证实，两种药物均不能有效减慢该疾病的进展。因此，寻找相关药物干预瓣膜钙化，对延缓和抑制瓣膜的发生发展具有重要的临床价值和意义。
[0003]瓣膜间质细胞在机械、脂蛋白、炎症应激等持续刺激下可转化为成骨样细胞，其特征是表达成骨细胞和软骨细胞分化相关的转录因子(Runx2、 Osterix和Sox9)和矿化调节蛋白(ALP碱性磷酸酶、osteopontin骨桥蛋白、 osteocalcin骨钙素、osteonectin骨连接蛋白、collagenase I和II型、bonemorphogenic proteins骨形态发生蛋白)，引起成骨性磷酸钙盐在瓣膜沉积，最终导致瓣膜钙化。因此，瓣膜间质细胞在CAVD病理变化过程中起关键作用，对深入剖析该疾病发生和发展过程中的细胞
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分子生物学机制至关重要。
[0004]JQ1是一种BET bromodomain抑制剂，作用于BRD4，结合到BET家族的所有溴结构域，而不结合到BET家族以外的溴结构域，BRD4全称为 bromodomain
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containing protein 4，即溴结构域蛋白4，属于BET家族成员， BET溴结构域(bromodomain and extra
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terminal domain)包含四种蛋白，即BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BET具有保守的模块化结构：包括两段N
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末端串联BRD效应模块(BD1和BD2)，一段额外的末端基团(ET)，几组保守的区域(A， B，SEED区域)和C
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末端区域(CTM)。化合物Apabetalone(RVX
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208)，来自于一种植物多酚
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白藜芦醇的衍生物。该化合物最初由Resverlogix研发。该化合物显示出对BRD4 BD2更强的抑制活性(对BRD4BD2的Kd为135nM，对BRD4 BD1的Kd为1142nM)。这种选择性可能是由于化合物的苯环能够与BD2的 His433形成π
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π堆积作用，而BD1中对应的氨基酸为半胱氨酸。Apabetalone (RVX
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208)能够有效降低高血脂糖尿病患者的血脂，用于治疗前驱糖尿病的研究处于临床二期，用于治疗动脉粥样硬化、急性冠脉综合症(ACS)，文献报导 BRD4能通过增加Runx2表达增加成骨样分化，而现如今JQ1抑制OM诱导瓣膜间质细胞成骨样分化的讲究尚未得到报告。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是研究JQ1是否可以减弱人瓣膜间质细胞(hVIC)的钙化， JQ1处理OM诱导的hVIC细胞，使用CCK8分析和茜素红S染色评估hVIC的增殖能力和钙化程度，qRT
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PCR，Western印迹和免疫荧光染色检测hVIC中与钙化相关的标记基因(RUNX2和ALP)的表达情况，证明BDR4抑制剂于该领域疾病和药物中具有效果，而提出的含有BRD4抑制剂治疗钙
化性主动脉瓣膜疾病的药物。
[0006]含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物，包括BRD4抑制剂，且所述BRD4抑制剂为JQ1抑制剂。
[0007]含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物的应用，所述钙化性主动脉瓣膜疾病为心脏瓣膜钙化病变。
[0008]本研究旨在研究JQ1是否可以减弱人瓣膜间质细胞(hVIC)的钙化，JQ1 处理OM诱导的hVIC细胞，使用CCK8分析和茜素红S染色评估hVIC的增殖能力和钙化程度，qRT
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PCR，Western印迹和免疫荧光染色检测hVIC中与钙化相关的标记基因(RUNX2和ALP)的表达情况。
附图说明
[0009]图1为本专利技术中JQ1处理hVIC的细胞活力和钙化水平示意图；
[0010]图2为本专利技术中对OM诱导的hVIC中钙相关基因/蛋白质表达的影响示意图；
[0011]图3为本专利技术中沉默BRD4抑制OM诱导的瓣膜间质细胞成骨样分化示意图。
具体实施方式
[0012]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0013]实施例一：
[0014]1、材料和方法
[0015]1.1、人原代瓣膜间质细胞的提取与培养
[0016](1)、将第一部分收集正常主动脉瓣膜放入15ml的离心管，用4℃冰盒中转运到超净工作台中，倒掉培养基，将瓣膜转移入无菌六孔板中，用含双抗的无菌PBS反复冲洗6次。
[0017](2)、将瓣膜小心移入一个15ml无菌离心管中，加入(2mg/ml)I 型胶原酶溶液10ml，置于37℃，5％的CO2培养箱中10h，每隔2个小时摇晃一下，待瓣膜组织分解成絮状、分散完全时即可。
[0018](3)、500g离心5分钟，弃上清，底部沉淀即为消化好的原代细胞。
[0019](4)、加入4ml含10％FBS的培养基溶液，充分混匀，在将细胞悬液加入无菌培养瓶中，轻轻摇晃使之平铺均匀，放入37℃，5％CO2培养箱中。
[0020](5)、在2
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3天后，观察细胞均已贴壁，更换培养基，待细胞增殖生长达培养瓶面积的80
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90％时，再传代。
[0021](6)、传代：弃去培养基，在培养瓶中加入胰酶1ml显微镜下消化30s，弃去胰酶，加入6ml完全培养基。用无菌吸管吹打培养瓶底部，使贴壁细胞脱落成均匀的细胞悬液并移入两个培养瓶中，按每个T25培养瓶3ml溶液的比例，转移至培养箱中继续培养。
[0022](7)、原代细胞分裂增殖能力是有限的，从接种到下一次传代一般需要5
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7天左右，按1:2传代。传代至第6
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7代以后，其细胞停止分裂增殖、细胞活性变差，不能满足实验需求，故而选取3
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5代细胞进行相关实验检测。
[0023]1.2、CCK8检测
[0024]本实施例采用CCK8检测试剂盒。实验操作简述如下：
[0025](1)、取104个VICs细胞悬液加入到96孔培养板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有BRD4抑制剂治疗钙化性主动脉瓣膜疾病的药物，其特征在于，包括BRD4抑制剂，且所述BRD4抑制剂为JQ1抑制剂。2.含有BRD4抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗涛，尚玉强，王怡轩，陈玉麒，戴仕林，章宏峰，余易珂，
申请(专利权)人：武汉市中心医院，
类型：发明
国别省市：