一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测羊乳制品(高温灭菌羊奶、羊奶粉)中掺假牛乳的小分子标记物方法，包括：1)将适量羊乳制品离心去除脂肪后置于容器中，加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；2)加入小分子物质萃取液，离心分离上清液；3)干燥后用50％甲醇溶液复溶，高分辨液相色谱串联质谱测定，4)维生素H可用于检测高温灭菌羊奶和羊奶粉中掺假牛乳源成分的标记物，检测水平为0.1％。本检测方法利用高分辨液相色谱串联质谱检测羊乳制品中的小分子标记物对羊乳制品掺假牛乳进行定性和定量，方法简单，分析速度快，灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物


[0001]本专利技术属于乳品检测分析
，具体要求涉及一种基于小分子标记物鉴别羊乳制品掺假牛乳的精准方法，特别涉及一种用高分辨率质谱仪测定羊乳制品掺假牛乳的小分子标记物的高灵敏度检测方法。

技术介绍

[0002]羊乳具有蛋白含量高、致敏性低、易于消化吸收等优点，被国际营养学界称为乳中之王。然而其产量低、价格高，为获取高额利润，市场时常出现羊乳掺假牛乳现象，牛乳过敏人群饮用后，牛奶中的过敏原会导致机体的生理功能紊乱，并可能引起组织损伤，从而导致一系列的临床症状，对消费者健康造成影响。此外，乳品掺假为不法分子谋取非法利益的同时，也损害了消费者的合法权益。
[0003]目前对羊乳中掺假牛乳的检测方法主要是基于DNA的PCR法和基于蛋白质组学的质谱法，在申请号为CN201610363584.8的中国专利申请中公开了一种羊乳粉中牛乳成分检测方法，其是通过普通PCR 对掺假模型进行分级，利用荧光定量PCR获得处于各个相应等级的 Ct值与掺假比例的关系式，之后通过普通PCR确定待检样品的等级，然后对待检样品进行荧光定量PCR获取Ct值，代入到相应级别的关系方程中从而计算出羊乳粉中牛乳成分的百分含量。虽然基于DNA 的PCR扩增方法具有快速、简便的特点，但也存在准确率低的缺陷，由于乳粉中DNA来源于体细胞，体细胞数量的多少对DNA的制备有明显的影响，因此，导致这种基于DNA的方法检测掺假时存在误差大的缺陷。在申请号为CN201611082298.0的中国专利申请中，公开了一种测定羊乳粉中牛乳粉掺假比例的方法，通过向待测样品中加入内标羊乳特征肽和内标牛乳特征肽，测定不同掺假比例中内标羊乳特征肽和内标牛乳特征肽与其对应内标特征肽的比值制成标准曲线，进而通过待测样品峰面积比，即可求得羊乳与牛乳的比例，但由于该方法需要添加蛋白酶对乳粉蛋白进行酶解，酶的添加量和酶解温度以及时间都会对产生的肽段造成影响，进而影响其准确性和灵敏度。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术检测羊乳制品存在的不足和缺点，例如，需要添加额外的对结果可能影响的试剂，本专利技术提供了一种基于高分辨液相色谱串联质谱的既能够用于热处理的羊乳掺假牛乳的检测，也适用于羊乳粉中牛乳掺假的检测方法。
[0005]一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的前处理方法，包括：
[0006]1)将适量羊乳制品的液态待测乳样去除脂肪后置于容器中；
[0007]2)加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；
[0008]3)分别加入适量有机溶剂和有机酸，震荡提取上清液后冻干；
[0009]4)加入适量混合液，离心提取上清液后即得待测液；
[0010]所述混合液为50％甲醇
‑
水溶液，优选地，所述混合液由等体积的甲醇与水溶液混合配制而成。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述标准品为2
‑
氯苯丙氨酸；所述有机酸为乙酸。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙醇、乙腈。
[0013]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述振荡是于4℃摇床中以 750
‑
1000rpm振荡处理。
[0014]本专利技术还提供了利用上述前处理方法在检测羊乳制品掺假牛乳的中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，包括：
[0016]a)通过权利要求1
‑
4中任一项所述的前处理方法对羊乳制品样品进行前处理，获得待测液；
[0017]b)使用液相质谱仪测定所述待测液和羊乳对照品中的小分子标记物；
[0018]c)通过小分子标记物的测定结果确定羊乳制品样品是否掺加牛乳；
[0019]所述小分子标记物为维生素H；
[0020]当羊乳制品为高温灭菌羊奶或羊粉时，优选维生素H为特征小分子标记物。在根据本专利技术的一个实施方案中，还包括：
[0021]d)若步骤c)确定羊乳制品样品中掺加牛乳，则基于测定得到的小分子标记物计算羊乳制品样品中的牛乳含量。
[0022]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述的小分子标记物的测定是以羊乳制品为比较组，牛乳制品中对应小分子标记物的差异倍数(FC) 和P值(P<0.05)确定的；
[0023]优选地，基于Compound discoverer软件对质谱图谱和数据处理后计算得到差异位数和P值。
[0024]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述的高分辨液相色谱串联质谱的液相色谱条件为：
[0025]流动相A为0.2％甲酸。流动相B为乙腈。优选地，梯度浓度为：
[0026]0～2min(100％A)
[0027]2～12min(100％～0％A)
[0028]12～16min(0％A)
[0029]16～16.1min(80～100％A)
[0030]16.1～18min(100％A)
[0031]进样量为5μL，流速为0.2mL/min，柱温为30℃。
[0032]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述的高分辨液相色谱串联质谱的质谱条件为：
[0033]离子源：ESI；
[0034]扫描方式：正离子；
[0035]喷雾电压：3200V；
[0036]离子传输管温度：320℃；
[0037]正离子的扫描质量范围：100
‑
1000(m/z)；
[0038]自动增益控制(AGC)靶：200,000；
[0039]最大离子注入时间：50ms。
[0040]本专利技术的有益效果在于：
[0041]本专利技术提供的检测方法以牛乳制品中的小分子作为标记物，对羊乳制品掺假牛乳进行检测分析，方法简单，分析速度快，灵敏度高。对于弥补和加强羊乳中掺假牛乳的检测方法，保障消费者健康和权益具有重要的意义。
附图说明
[0042]图1为高温灭菌羊奶、牛奶以及羊奶粉、牛奶粉的小分子标记物质谱图；
[0043]图2为掺假高温灭菌羊奶中差异标记物维生素H的掺假比例与差异倍数的线性关系图；
[0044]图3为掺假羊奶粉中差异标记物维生素H的掺假比例与差异倍数的线性关系图。
具体实施方式
[0045]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但并不因此将本专利技术限制在所述实施例范围之中。
[0046]实施例1羊乳掺假牛乳中小分子标记物的测定
[0047]取1mL羊、牛乳样品至1.5mL离心管，加10μL浓度为3mg/mL 的2
‑
氯苯丙氨酸作为内标，和30μL 33％乙酸用于沉淀蛋白和调节pH 值，涡旋静置，于4℃，10000
×
g，离心15
‑
20min。小心吸取全部上清液，转移至2mL离心管冻干，加2mL 90％乙醇、5μL乙腈和 30μL 33％乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物，其特征在于，包括：1)将适量羊乳制品的离心去除脂肪后置于容器，加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；2)加入小分子物质萃取液，离心分离上清液；3)干燥后用50％甲醇溶液复溶，高分辨液相色谱串联质谱测定。2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述标准品为2
‑
氯苯丙氨酸；所述有机酸为乙酸。3.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醇、乙腈。4.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述振荡是于4℃摇床中以750
–
1000rpm振荡处理。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的前处理方法在检测羊乳制品掺假牛乳的中的应用。6.一种利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，包括：a)通过权利要求1
‑
4中任一项所述的前处理方法对羊乳制品样品进行前处理，获得待测液；b)使用高分辨液相色谱串联质谱仪测定所述待测液和羊乳对照品中的小分子标记物；c)通过小分子标记物的测定结果确定羊乳制品样品是否掺加牛乳；所述小分子标记物为维生素H。7.如权利要求6所述的利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，还包括：d)若步骤c)确定羊乳制品样...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩荣伟，解书斌，孙雪恒，王军，都启晶，范荣波，杨永新，姜洪宁，于忠娜，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：