病毒样颗粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种病毒样颗粒及其构建方法和应用，属于生物医学工程领域。本发明专利技术基于二代慢病毒载体系统，提供了一种包含冠状病毒属新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的Narm和NTD区域的慢病毒载体，同时通过改造psPAX2系统质粒，获得了具有更高RNA核载量的病毒样颗粒，且无病毒基因组整合风险，可以用于核酸检测质控品的制备、疫苗制备和基因治疗药物递送。送。送。

【技术实现步骤摘要】
病毒样颗粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，具体涉及一种病毒样颗粒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]基因治疗和病毒核酸诊断质控品领域使用的病毒类的载体主要包括：慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和AAV等。腺病毒的强免疫原性限制了其全身用药，AAV的基因荷载量较小，也制约了其应用范围。相比而言，慢病毒载体从免疫原性和基因荷载量方面有较强的优势。其中，慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV
‑
1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
[0003]冠状病毒为非节段单链(+)RNA病毒，基因组约29
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31kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5
’
端有甲基化“帽子”，3
’
端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了RNA
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DNA
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RNA的转录过程。
[0004]冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群，其中，HCoV
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229E、HCoV
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OC43、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、SARS
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CoV(引发重症急性呼吸综合征)、MERS
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CoV(引发中东呼吸综合征)及2019新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)均属于该病毒属。
[0005]新冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60
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220nm，含有四种结构蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)；核衣壳蛋白(N，Nucleocapsid，主要作用是跟病毒的RNA结合)。其中，核衣壳蛋白是病毒粒子的核心成分，它与病毒基因组RNA结合，将RNA包装成核糖核蛋白(RNP)复合体。新型冠状病毒SARS
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CoV
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2N蛋白全长419个氨基酸，由N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)以及连接两个结构域及其两侧的三段无规则柔性区(IDR)构成。
[0006]专利CN202010172424.1公开了一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019
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nCov的假病毒标准品及其应用，该假病毒标准品是通过基因合成、质粒抽提和假病毒包装等步骤制备而成，其中合成的基因包括新型冠状病毒2019
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nCov基因RdRp、Gene E和Gene N，所述的假病毒标准品具有较好的检测限、特异性、重复性等，且无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应。专利CN202010750559.1则公开了一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质及其制备方法，将新型冠状病毒核酸整合至慢病毒表达质粒载体中，然后将构建的慢病毒表达质粒与包装质粒共同转染至细胞中，经细胞表达后得到大量包装了新型冠状病毒RNA的假病毒颗粒。其既有包装了病毒的部分RNA序列，又有包装了
全部序列的假病毒标准物质，能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测全过程，可用于新型冠状病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控制。
[0007]然而，将慢病毒作为基因治疗载体，进行全身性给药以及作为病毒核酸诊断质控品时，其整合性带来了一定的临床运用的安全风险。基于此，亟需开发一种具有更高的RNA病毒荷载量，且无整合风险的病毒样颗粒。

技术实现思路

[0008]针对上述不足，本专利技术提供了一种病毒样颗粒及其构建方法和应用。本专利技术基于二代慢病毒载体系统，提供了一种包含冠状病毒属新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的Narm和NTD区域的慢病毒载体，同时通过改造psPAX2系统质粒，获得了具有更高新型冠状病毒RNA核载量的假病毒颗粒，且无病毒基因组整合风险，可以用于核酸检测质控品的制备、疫苗制备和基因治疗药物递送。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]一方面，本专利技术提供了一种病毒载体，所述的病毒载体包括冠状病毒属新型冠状病毒N蛋白，所述的N蛋白包含Narm和NTD区域(Narm
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NTD)或D63G、L139R突变的Narm和NTD区域(Narm
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NTD
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MUT)。
[0011]具体地，所述的Narm
‑
NTD的编码序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的Narm
‑
NTD
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MUT的编码序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0012]进一步具体地，所述的Narm
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NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列；所述的Narm
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NTD
‑
MUT的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示的序列。
[0013]具体地，所述的载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。
[0014]进一步具体地，所述的载体为慢病毒载体，优选为psPAX2载体。
[0015]进一步具体地，所述的psPAX2载体中HIV病毒的核蛋白区域(NC)的C端通过G4S链接新型冠状病毒的N蛋白序列。
[0016]进一步具体地，所述的psPAX2载体中完全缺失HIV的逆转录酶(RT)和整合酶基因(Int)序列。
[0017]另一方面，本专利技术提供了上述病毒载体在制备病毒样颗粒中的应用。
[0018]又一方面，本专利技术提供了一种新型冠状病毒病毒样颗粒，所述的病毒样颗粒由上述病毒载体制备得到。
[0019]又一方面，本专利技术提供了包含上述病毒载体或病毒样颗粒的细胞。
[0020]又一方面，本专利技术提供了上述病毒载体、病毒样颗粒或细胞在制备病毒核酸检测质控品、制备疫苗和基因治疗药物递送中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的积极和有益效果在于：
[0022](1)本专利技术采用优化后的新型冠状病毒N蛋白Narm和NTD区域的核苷酸编码序列制备病毒性颗粒，其病毒的RNA荷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒载体，其特征在于：所述的载体包括冠状病毒属新型冠状病毒N蛋白，所述的N蛋白包含Narm和NTD区域Narm
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NTD或D63G、L139R突变的Narm和NTD区域Narm
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NTD
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MUT；所述的Narm
‑
NTD的编码序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的Narm
‑
NTD
‑
MUT的编码序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的Narm
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NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列；所述的Narm
‑
NTD
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MUT的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示的序列。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘骏，周春艳，金丽，谢伟建，昌慧鑫，肖倩，
申请(专利权)人：复百澳苏州生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：