Grx-roGFP/Gpx3-roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法技术

本发明专利技术公开了Grx

【技术实现步骤摘要】
Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法。

技术介绍

[0002]本细胞系是靶向线粒体的Grx
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roGFP和Gpx3
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roGFP马丁达比狗肾细胞(MDCK)稳转细胞系。众所周知，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是一类化学性质活泼，氧化能力很强的含氧物质，对机体造成众多危害，很多疾病的发生发展均与活性氧有密切关联。故探究ROS水平变化对于深入探讨药物或毒物或自身所处内环境有重要意义。
[0003]线粒体为胞内活性氧自由基产生的重要场所，精细结构和复杂功能使其成为多种外源性物质的初始靶向细胞器。线粒体内膜通透性与电子传递链完整性是决定线粒体功能状态的主要因素，而线粒体的功能状态与细胞的生长、增殖分化和死亡等生理活动紧密相关。且相比于其他细胞器，线粒体对各种损伤最为敏感。因此，检测线粒体内ROS的水平对于研究机体内环境及探求机制具有重要意义。
[0004]目前传统检测ROS的方法主要有两种类型：
[0005]1)间接测量与氧化还原相关的物质。如采用高效液相色谱或凝胶电泳等方法分离提取NADPH，ascorbic acid，GSH和Trx等物质；或通过酶法间接检测相关的超氧岐化酶(superoxide dismutase，SOD)，催化酶，总过氧化酶，抗坏血酸过氧化酶的活性，以及脂过氧化酶，蛋白质氧化酶，谷胱甘肽还原酶等。间接测量法缺点为需要破坏细胞，分离组织，提取目标物，从而人为地造成氧化损伤，不能进行动态测量，无法分辨亚细胞水平的氧化还原情况。
[0006]直接检测ROS。主要分为基于荧光素类化合物的检测方法与电子自旋共振(ESR)法。荧光素探针如2',7'
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二氯二氢荧光素(2',7'
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dihydrodichlorofluore
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scein，H2DCF)被H2O2氧化时能产生荧光，但是除了H2O2，H2DCF还能被金属离子，过氧化酶和细胞色素c等氧化，特异性差。ESR法对样品制备要求较高，且只能测得样品细胞ROS的平均值，操作复杂、费用昂贵。其他方法如化学染色剂3,3'
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二氨基联苯胺(3,3'
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diaminobenzidine，DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium Blue chloride，NBT)可与活性氧反应生成沉淀，是传统的ROS原位(in situ)检测方法，但是此应用受到底物吸收、细胞渗透、组织固定等因素影响。且荧光试剂和染色剂都存在细胞毒性、无可逆性和非活体检测等缺点，不能对细胞中的ROS发展进行实时动态观察。
[0007]目前研究活性氧的方法尚存在很多不足与局限，因此开发一种高效、无毒并且能够实时动态监测ROS水平的方法势在必行，现有马丁达比狗肾细胞(Madin
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Darby Canine Kidney,MDCK)属狗肾远曲小管上皮细胞，其结构和生化作用类似于人肾上皮细胞，在支撑网膜上生长能形成结构和功能完整的细胞单层，是研究肾组织生理、生化过程的最佳工具，也是了解药物、毒物或代谢物在肾远曲小管转运的理想模型，综上所述，亟需构建一种Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系模型。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法，其构建方法步骤如下：
[0011]步骤一：首先将目的基因Grx
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roGFP和Gpx
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roGFP克隆至慢病毒载体pLV
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puro上；
[0012]步骤二：进一步用慢病毒载体pLV
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W包装成慢病毒后感染MDCK细胞，通过puromycin筛选W基因过表达稳定细胞株，从而，构建了可实时动态观察肾细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：所述步骤一的具体步骤如下：
[0014]S1：首先选取双酶切基因片段Grx
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roGFP和Gpx
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roGFP和载体；
[0015]S2：进一步将酶切好的Grx
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roGFP和Gpx
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roGFP连接到pLV
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puro载体上；
[0016]S3：进一步进行PCR克隆鉴定。
[0017]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤二的具体步骤如下：
[0018]S1：首先进行质粒提取；
[0019]S2：进一步进行慢病毒包装；
[0020]S3：进一步感染慢病毒感染MDCK细胞和并进行筛选。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0022]1、本专利技术将Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP转染至MDCK细胞线粒体中，构建了可实时动态观察肾细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系，为研究肾脏内毒物，药物，代谢物引起的活性氧病变提供了原位模型；
[0023]2、本专利技术选取准确反应线粒体内氧化还原动态的GSH及H2O2，将可特异性检测GSH的谷氧还蛋白(Glutaredoxin，Grx)与特异性检测H2O2的谷胱甘肽过氧化酶Gpx3和roGFP融合。通过观测Grx
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roGFP及GPX3
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roGFP可实时动态检测细胞内谷胱甘肽和H2O2，从而推测细胞体内氧化还原状态的变化，揭示活性氧的致病机理。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例中，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]本专利技术实施例中，Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法，其构建方法步骤如下：
[0026]步骤一：首先将目的基因Grx
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roGFP和Gpx
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roGFP克隆至慢病毒载体pLV...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆细胞系构建方法，其特征在于：其构建方法步骤如下：步骤一：首先将目的基因Grx
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roGFP和Gpx
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roGFP克隆至慢病毒载体pLV
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puro上；步骤二：进一步用慢病毒载体pLV
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W包装成慢病毒后感染MDCK细胞，通过puromycin筛选W基因过表达稳定细胞株，从而，构建了可实时动态观察肾细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系。2.根据权利要求1所述的Grx
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roGFP/Gpx3
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roGFP基因过表达MDCK单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娜，李筱楠，吴秀稳，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：