用于检测SMA中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统技术方案

本发明专利技术涉及用于检测SMA中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统，其中所述用于检测SMA疾病相关基因突变的方法包括以下步骤：（1）提供受试者基因组DNA样本；（2）用引物组通过PCR扩增所述基因组DNA样本中的SMN基因；（3）构建三代测序文库；和（4）进行三代测序并分析基因突变类型。突变类型。

【技术实现步骤摘要】
用于检测SMA中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统


[0001]本专利技术涉及基因检测
，更特别涉及用于检测SMA中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）是一组由染色体5q13上SMN1基因纯合缺失引起的常染色体隐性遗传病1。临床表现为进行性肌无力和萎缩，伴有脊髓退变，在最严重的患者中，会导致下运动神经元受损。SMA是婴儿死亡的主要遗传原因之一，几乎在所有人群中均有发现；据统计，SMA的发病率为每6000
‑
11000例活产婴儿中有一例患儿，I型SMA的发病率为每10万例活产婴儿中有4.1例。在普通人群中SMN1突变的携带频率为2%至3%（40分之一）
2, 3
。尽管人群携带频率很高，但SMA的发生率低于预期。这可能反映了一些胎儿具有0/0的SMN1/SMN2基因型(即根本不存在SMN蛋白)，导致胚胎死亡4。
[0003]SMA的自然病程和检查结果取决于表型变异，并在临床上分为SMA“类型”。在所有SMA类型中，下面概述了SMA的五种类型：0型SMA出现在新生儿期，死亡通常发生在出生时或出生后的第一个月内；I型SMA的特征是在出生时或前三个月内出现严重的全身肌肉无力和肌肉张力减退。呼吸衰竭导致的死亡通常发生在头两年内；II型SMA患儿能够坐下，但他们不能独立站立或行走，并且通常可以存活超过四年；III型SMA是一种较轻的形式，在婴儿期或青年时期发病，III型SMA患者学会独立行走并具有较长的存活率；IV型SMA，患者出现在成年期并且是SMA最温和的表型1。
[0004]存活运动神经元(SMN)基因包含九个外显子，长度约28kb，5q13上存在两个几乎相同的SMN基因：SMN1基因与SMN2基因。由于SMN2中第7外显子中产生关键的单核苷酸突变，导致SMN2基因产生的功能更少的SMN蛋白，仅为SMN1的10
‑
15%5。大约95%的SMA患者具有SMN1基因的纯合缺失，而5%具有复合杂合突变。大多数SMA患者存在涉及SMN1基因外显子7的纯合缺失，且依赖于残余SMN2产生功能性SMN蛋白。因此，SMN2的拷贝数与表型严重程度之间存在正相关，大多数重症I型患者有一个或两个SMN2拷贝；大多数II型患者有3个SMN2拷贝；并且大多数III型患者有3或4个SMN2拷贝。正常人群中SMN2的拷贝数从零到三个不等，其中大约10%
–
15%的人群没有SMN26。
[0005]目前分子检测SMA最常用的方法是通过MLPA或qPCR检测大片段缺失或拷贝数变异，结合Sanger测序特异性检测SMN1基因上的点突变7。但是MLPA只能根据基因拷贝数检测SMN1的缺失，不能检测SMN1的点突变。大约5%的SMA患者携带一个具有点突变的SMN1的拷贝。因此，一些SMA患者难免被误诊为携带者8。此外MLPA与qPCR也不能识别SMN1 (2 + 0)沉默携带者，造成携带者假阴性的误判9。又因为SMN1与SMN2的高度同源性，SMN2上也会存在SMN1上特征性序列，也会干扰Sanger测序时PCR扩增引物和测序引物的特异性，在实际检测中会导致漏诊和误诊。同时，常规诊断方法不区分SMN1的缺失和SMN1是否与SMN2发生同源重组。
[0006]二代测序（Next
‑
generation sequencing, NGS）需要对SMN1和SMN2分别构建NGS
测序文库，才能特异性检测SMN1基因或者SMN2的点突变，不能与其他基因检测兼容，且流程比较繁琐
10
。目前发表的研究SMN基因完整序列的方法包括全基因组测序（WGS）和多重直接基因组选择（MDiGS）测序。WGS是一项相当昂贵和费力的技术，通常需要复杂的生物信息学分析。在MDiGS中，整个 DNA在文库中制备，实验步骤同样相当繁杂
11, 12
。
[0007]目前基于qPCR、MLPA、Sanger测序或二代测序的方法，可以实现SMN1与SMN2基因拷贝数和检测部分的点突变检测，但检测主要有以下几方面局限性： 1、无法实现在同一体系内同时检测SMN1与SMN2基因所有点突变类型与拷贝数变异的检测；2、由于SMN1与SMN2之间存在多次重组的可能性，影响MLPA探针的结合和Sanger测序引物的设计，会导致一定程度的漏检和误检；3、无法检测SMN1与SMN2基因全长，且受到检测范围影响，无法对外显子1进行检测；4、当同一个基因位点上同时存在两个或多个突变时，现有的方法无法区分顺式还是反式突变，以及突变是否具有连锁效应；5、无法对SMN1 (2 + 0)型沉默携带者进行检测。
[0008]现阶段SMA致病基因覆盖不全、SMN1与SMN2的拷贝数检测困难、无法确定突变是否连锁等会导致临床上存在漏检和误检的问题。
[0009]因此，非常需要寻找一种新的方法，以实现高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个样品SMA相关2个致病基因的多种突变。

技术实现思路

[0010]基于引物组的设计、长片段PCR扩增和三代测序的方法来检测SMA相关2个致病基因的多种突变，可以实现方法操作简便、长片段PCR和三代文库质量可靠且重复性强、有利于三代测序技术在临床检测上的应用，进而解决上述问题。
[0011]根据本申请的第一方面，提供用于扩增SMN基因的引物组，其中所述引物组包含如下引物：SMN
‑
FL
‑
F与SMN
‑
FL
‑
R；以及SMN
‑
DOWN
‑
F与SMN
‑
DOWN
‑
R；其中所述引物组中SMN
‑
FL
‑
F位于SMN1和SMN2基因上游的同源区域，SMN
‑
FL
‑
R位于SMN1和SMN2的7号外显子c.840下游的同源区域，SMN
‑
FL
‑
F和SMN
‑
FL
‑
R扩增长度不超过35kb；SMN
‑
DOWN
‑
F位于SMN1和SMN2的7号外显子c.840上游的同源区域，SMN
‑
DOWN
‑
R位于SMN1和SMN2基因下游的同源区域，SMN
‑
DOWN
‑
F和SMN
‑
FL
‑
R扩增长度不超过35kb。
[0012]在一种实施方案中，所述引物组的扩增产物用于构建三代测序文库，并通过三代测序同时检测SMN1与SMN2的拷贝数和点突变，以及SMN1 (2 + 0)沉默携带者，其中点突变至少包含如表1所示的SMN1基因上的190种点突变。
[0013]在一种实施方案中，所述引物组的扩增产物用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于扩增SMN基因的引物组，其中所述引物组包含如下引物：SMN
‑
FL
‑
F与SMN
‑
FL
‑
R；以及SMN
‑
DOWN
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F与SMN
‑
DOWN
‑
R；其中所述引物组中SMN
‑
FL
‑
F位于SMN1和SMN2基因上游的同源区域，SMN
‑
FL
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R位于SMN1和SMN2的7号外显子c.840下游的同源区域，SMN
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FL
‑
F和SMN
‑
FL
‑
R扩增长度不超过35kb；SMN
‑
DOWN
‑
F位于SMN1和SMN2的7号外显子c.840上游的同源区域，SMN
‑
DOWN
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R位于SMN1和SMN2基因下游的同源区域，SMN
‑
DOWN
‑
F和SMN
‑
FL
‑
R扩增长度不超过35kb。2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组的扩增产物用于构建三代测序文库，并通过三代测序同时检测SMN1与SMN2的拷贝数和点突变，以及SMN1 (2 + 0)沉默携带者，其中点突变至少包含如表1所示的SMN1基因上的190种点突变。3.根据权利要求2的引物组，其中所述引物组的扩增产物用于构建三代测序文库，并通过三代测序检测扩增产物中同一扩增片段内的不同突变是否连锁。4.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物可在5
’
端加上5
‑
50nt不同序列的DNA，即DNA条形码，以区分不同样本。5.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物SMN
‑
FL
‑
F选自SEQ ID NOs：1
‑
4，SMN
‑
FL
‑
R选自SEQ ID NOs：5
‑
8，SMN
‑
DOWN
‑
F选自SEQ ID NOs：9
‑
12，SMN
‑
DOWN
‑
R选自SEQ ID NOs：13
‑
16。6.根据权利要求2所述的引物组，其中所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。7.用于扩增SMN基因的试剂盒，其包含DNA聚合酶、反应缓冲液和根据权利要求1
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳琪，卢玉林，孟万利，詹嘉晗，毛爱平，张丽，任志林，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：