一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用，属于环境科学领域。本发明专利技术通过对来源于Thermobifida fusca来源角质酶TfC进行改造得到一系列突变体，所述突变体是在所述TfC的底物结合位点附近发生单点或多点突变，对其第65位、第92位、第184位、第209位、第213位发生突变，构建得到9种突变体。与野生型TfC相比，本发明专利技术所述9种TfC的突变体(M1

【技术实现步骤摘要】
一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用


[0001]本专利技术涉及一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用，属于环境科学领域。

技术介绍

[0002]聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是塑料的一种，因其具有高机械强度、低透气性、重量轻、成本价格低等优点，目前已在全世界范围内得到了广泛的应用。大量PET废弃物因得不到有效回收、自然状态下难以降解，导致PET在全球生态体系中积累使得土地营养成分流失土壤板结，并且大量漂流在海洋上的塑料会对海洋生态系统造成毁灭性地打击。目前，填埋、焚烧、物化回收处理方式造成能源的浪费又对环境产生极其严重的影响。故生物降解被认为是控制塑料污染最有效的方法。
[0003]各种PET水解酶陆续被鉴定并证明能够在不同程度上降解PET，如Ideonella sakaiensis的PETase，植物堆肥中的宏基因组的LC角质酶，Saccharomonora viridis AHK190的角质酶，Thermomyces insolens的HiC，及Candida antarctica的脂肪酶B等。虽然部分鉴定的PET水解酶已显示具有相对较高的降解性，但其降解效果远达不到规模化降解要求。
[0004]2008年，Chen等人对来源于嗜热假单胞菌的角质酶(Thermobifida fusca cutinase)进行研究，它具有良好耐热性并能催化酯键水解，具有将PET降解为对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)的效果。尽管如此，该酶催化效率较低，因此需通过定点突变对该酶的结构进行改造，使其降解PET的效率得到提高，实现PET的高效生物降解。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服角质酶降解PET效率低的不足，提供了新的角质酶的突变体及应用。本专利技术合成了来源于Thermobifida fusca能够水解PET的角质酶TfC并对其进行了表达纯化，通过研究TfC的结构后，针对其活性区参与底物相互作用的氨基酸进行突变，以增加酶对底物PET的活力。
[0006]本专利技术提供了角质酶突变体，所述突变体包含对应于SEQ ID NO:1所示多肽的第65位、第92位、第184位、第209位、第213位的取代；其中，
[0007]所述角质酶突变体与SEQ ID NO:1所示的第1到261位的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。
[0008]在一种实施方式中，
[0009]所述第65位的取代是用赖氨酸取代丙氨酸；
[0010]所述第92位的取代是用甘氨酸取代为谷氨酰胺；
[0011]所述第184位的取代是用丝氨酸取代组氨酸；
[0012]所述第209位的取代是用异亮氨酸取代苯丙氨酸；
[0013]所述第213位的取代是用赖氨酸取代异亮氨酸。
[0014]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，命名为TfC突变体M1(A65K)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0015]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，命名为TfC突变体M2(Q92G)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0016]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，命名为TfC突变体M3(H184S)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0017]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，命名为TfC突变体M4(F209I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0018]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸(I213K)，命名为TfC突变体M5(I213K)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
[0019]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸突变为丝氨酸，同时第209位氨基酸由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，命名为TfC突变体M6(Q92G/H184S/F209I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
[0020]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，同时第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸，命名为TfC突变体M7(Q92G/H184S/F209I/I213K)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
[0021]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，同时第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，命名为TfC突变体M8(A65K/Q92G/H184S/F209I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。
[0022]在一种实施方式中，所述的突变体是将SEQ ID NO:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，同时第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸，命名为TfC突变体M9(A65K/Q92G/H184S/F209I/I213K)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
[0023]本专利技术提供了编码所述突变体的多核苷酸。
[0024]本专利技术提供了包含权所述多核苷酸的核酸构建体、载体。
[0025]在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
[0026]在一种实施方式中，所述载体为pET24a，将编码所述突变体的多核苷酸插入pET24a载体的多克隆酶切位点处。
[0027]本专利技术提供了表达所述突变体、或包含所述多核苷酸的宿主细胞。
[0028]在一种实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.角质酶突变体，其特征在于，所述突变体包含对应于SEQ ID NO:1所示多肽的第65位、第92位、第184位、第209位和/或第213位的取代；其中，所述角质酶突变体与SEQ ID NO:1所示的第1到261位的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。2.根据权利要求1所述的角质酶突变体，其特征在于，所述第65位的取代是用赖氨酸取代丙氨酸；所述第92位的取代是用甘氨酸取代为谷氨酰胺；所述第184位的取代是用丝氨酸取代组氨酸；所述第209位的取代是用异亮氨酸取代苯丙氨酸；所述第213位的取代是用赖氨酸取代异亮...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，颜正飞，陈晓倩，王蕾，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：