眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及体外诊断检测技术领域，具体涉及一种眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法，通过从组织或血液中提取总RNA，将提取的总RNA用磁珠富集真核生物mRNA或用试剂盒去除原核生物的rRNA，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，构建DNA文库，将DNA文库用进行靶向捕获，得到靶向捕获文库并进行质检，得测序文库，进行测序；将原始测序序列去除接头和低质量碱基；将处理后的原始测序序列进行分析，并与原始测序序列相应的参考基因组信息进行对比；本发明专利技术可解决现有技术中对眼肿瘤融合基因检测操作复杂、成本高和样本投入大的问题，并为选择准确有效的眼部肿瘤治疗靶位奠定基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法


[0001]本专利技术涉及体外诊断检测
，具体涉及一种眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法。

技术介绍

[0002]融合基因是指两个基因全部或一部分相互融合为一个新基因的过程，是染色体异位、中间缺失或染色体倒置所致，通常具有致瘤性，在各种不同的肿瘤中普遍存在。融合基因是肿瘤的普遍特征，并可作为肿瘤分子的诊断和靶标。融合基因引发癌症的机制主要有两种：一部分发生在肿瘤驱动基因上的基因融合使这些基因拥有强的启动子或增强子，或激活转录因子，使其异常表达；另一部分融合基因会产生有生物学作用(如激酶活性等)的嵌合体蛋白，使生物体紊乱。可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1％
‑
9％，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR等。目前针对融合基因的肿瘤靶向药物已有多种获得FDA/CFDA批准，如针对ALK、ROS1基因融合的克唑替尼，以及针对NTRKs基因融合的Larotrectinib等。美国国家综合癌症网络(NCCN)指出，含有融合基因的患者可接受相应的靶向药物治疗，推荐的检测手段有高通量测序(NGS)、实时荧光定量PCR(RT
‑
PCR)、荧光原位杂交(FISH)，以及免疫组化(IHC)等。
[0003]由于FISH和IHC等方法具有通量低、检测周期长、费用昂贵等缺点，而RT
‑
PCR只能用来检测已知融合变异，NGS技术被越来越多用在肿瘤基因融合的检测上。基于此，开发一种更为简便、成本低和样本投入少的肿瘤融合基因检测方法。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术所要解决的问题是：如何提供一种眼肿瘤融合基因的检测模型及构建方法和检测方法，以解决现有技术中对肿瘤融合基因检测操作复杂、成本高和样本投入大的问题。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术采用了如下的技术方案：
[0006]一种构建基于转录组RNA
‑
seq的眼肿瘤融合基因检测模型的方法，包括：
[0007](1)基于融合基因设计探针；
[0008](2)从离体组织样本或血液中提取总RNA，并进行总RNA浓度和质量控制；
[0009](3)将提取的所述总RNA用磁珠富集真核生物mRNA或用试剂盒去除原核生物rRNA，加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后，进行末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段选择，经PCR扩增后，进行文库质检，获得DNA文库；
[0010](4)将所述DNA文库用进行靶向捕获，得到靶向捕获文库并进行质检，得测序文库，将所述测序文库用Illumina HiSeq进行测序；
[0011](5)将Illumina HiSeq测序得到原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测
序序列，将所述原始测序序列去除接头和低质量碱基；将处理后的原始测序序列进行分析，并与所述原始测序序列相应的参考基因组信息进行对比。
[0012]进一步，所述步骤(2)总RNA浓度和质量控制包括总RNA浓度≥20ng/ul、总RNA质量2.1≥OD
260/280
≥1.9。
[0013]进一步，所述步骤(4)中测序文库浓度≥5ng/ul。
[0014]进一步，所述步骤(1)中融合基因包括ABCB9、ABL1、ACKR3、ACSL3、ACTB、ADGRG7、AFF3、AHRR、AKAP12、AKAP9、ALDH2、ALK、ASPSCR1、ATF1、ATIC、BAG4、BAIAP2L1、BCOR、BCR、BRAF、BRD3、BRD4、C11orf95、CAMTA1、CANT1、CARS、CASP7、CATSPERZ、CCAR2、CCDC6、CCNB1IP1、CCNB3、CCND1、CCND3、CDH11、CDKN1A、CDX1、CHCHD7、CHN1、CIC、CIITA、CLTC、CNBP、COL12A1、COL1A1、COL1A2、COL4A5、COL6A3、COX6C、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CRTC1、CRTC3、CSF1、CSF1R、CTNNB1、CXorf67、DCTN1、DDIT3、DDX5、DLEU2、DUX4、EBF1、EGFR、EIF3E、EIF4A2、EML4、ELK4、EP300、EPC1、EPCAM、ERBB2、ERBB4、ERC1、ERG、ERLIN2、ESR1、ESRRA、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZR、FEV、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FHIT、FIP1L1、FLI1、FN1、FOXO1、FOXO4、FUS、GLI1、GOLGA5、GOPC、GPC3、HAS2、HERPUD1、HEY1、HJURP、HMGA1、HMGA2、HMGN2P46、HNRNPA2B1、HOOK3、HPR、IRF2BP2、JAZF1、KDR、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLF17、KLK2、KLK4、KLKP1、KRAS、KTN1、LGR5、LHFPL6、LIFR、LMO1、LPP、LRIG3、LRP1、MAML2、MBTD1、MEAF6、MET、CD74、MIPOL1、MN1、MRTFB、MSH2、MUTYH、MYB、MYC、NAB2、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NDRG1、NFATC1、NFATC2、NFIB、NONO、NOTCH1、NOTCH2、NR4A3、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP107、NUTM1、NUTM2A、NUTM2B、NUTM2E、OGA、OMD、PAFAH1B2、PATZ1、PAX3、PAX7、PAX8、PBX1、PBX3、PCM1、PCSK7、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PHF1、PIK3CA、PLAG1、PLPP3、POU5F1、PPARG、PPFIBP1、PRCC、PRKAR1A、PSPC1、PTGFRN、PTPRK、RAD51B、RAF1、RANBP2、RELCH、RET、RGS17、RMI2、ROS1、RPS10、RSPO2、RSPO3、RUNX1、RUNX1T1、SDC4、SDHA、SDHB、SDHD、SEC16A、SEC22B、SEC31A、SEPT14、SFPQ、SLC34A2、SLC45A3、SLC49A4、SMARCA5、SMARCB1、SMARCE1、SOX9、SP3、SRGAP3、SS18、SS18L1、SS18L2、SSX1、SSX2、SSX4、STAT6、SUZ12、TACC1、TACC3、TAF15、TBL1XR1、TCEA1、TCF12、TCF7L2、TEC、TENM4、TERT、TE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建基于转录组RNA
‑
seq的眼肿瘤融合基因检测模型的方法，其特征在于，包括：(1)基于融合基因设计探针；(2)从离体组织样本或血液中提取总RNA，并进行总RNA浓度和质量控制；(3)将提取的所述总RNA用磁珠富集真核生物mRNA或用试剂盒去除原核生物rRNA，加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后，进行末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段选择，经PCR扩增后，进行文库质检，获得DNA文库；(4)将所述DNA文库用进行靶向捕获，得到靶向捕获文库并进行质检，得测序文库，将所述测序文库用Illumina HiSeq进行测序；(5)将Illumina HiSeq测序得到原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，将所述原始测序序列去除接头和低质量碱基；将处理后的原始测序序列进行分析，并与所述原始测序序列相应的参考基因组信息进行对比。2.根据权利要求1所述构建基于转录组RNA
‑
seq的眼肿瘤融合基因检测模型的方法，其特征在于，所述步骤(2)总RNA浓度和质量控制包括总RNA浓度≥20ng/ul、总RNA质量2.1≥OD
260/280
≥1.9。3.根据权利要求1所述构建基于转录组RNA
‑
seq的眼肿瘤融合基因检测模型的方法，其特征在于，所述步骤(4)中测序文库浓度≥5ng/ul。4.根据权利要求1所述构建基于转录组RNA
‑
seq的眼肿瘤融合基因检测模型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中融合基因包括ABCB9、ABL1、ACKR3、ACSL3、ACTB、ADGRG7、AFF3、AHRR、AKAP12、AKAP9、ALDH2、ALK、ASPSCR1、ATF1、ATIC、BAG4、BAIAP2L1、BCOR、BCR、BRAF、BRD3、BRD4、C11orf95、CAMTA1、CANT1、CARS、CASP7、CATSPERZ、CCAR2、CCDC6、CCNB1IP1、CCNB3、CCND1、CCND3、CDH11、CDKN1A、CDX1、CHCHD7、CHN1、CIC、CIITA、CLTC、CNBP、COL12A1、COL1A1、COL1A2、COL4A5、COL6A3、COX6C、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CRTC1、CRTC3、CSF1、CSF1R、CTNNB1、CXorf67、DCTN1、DDIT3、DDX5、DLEU2、DUX4、EBF1、EGFR、EIF3E、EIF4A2、EML4、ELK4、EP300、EPC1、EPCAM、ERBB2、ERBB4、ERC1、ERG、ERLIN2、ESR1、ESRRA、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZR、FEV、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FHIT、FIP1L1、FLI1、FN1、FOXO1、FOXO4、FUS、GLI1、GOLGA5、GOPC、GPC3、HAS2、HERPUD1、HEY1、HJURP、HMGA1、HMGA2、HMGN2P46、HNRNPA2B1、HOOK3、HPR、IRF2BP2、JAZF1、KDR、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLF17、KLK2、KLK4、KLKP1、KRAS、KTN1、LGR5、LHFPL6、LIFR、LMO1、LPP、LRIG3、LRP1、MAML2、MBTD1...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，王海丽，韩路，
申请(专利权)人：北京迈基诺基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：