具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针及其制备方法与可视化标记策略技术

本发明专利技术公开了具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针及其制备方法与可视化标记策略，TP是梅毒螺旋体英文简称，本发明专利技术合成DBCO

【技术实现步骤摘要】
具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针及其制备方法与可视化标记策略


[0001]本专利技术涉及一种病原体标记成像
，尤其涉及活梅毒螺旋体标记技术。

技术介绍

[0002]梅毒螺旋体(Treponema Pallidum，TP)是一种非典型革兰氏阴性菌(Gram
‑
negative bacteriμm，G
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)，可通过性行为、血液、母婴等传播，引起心血管/骨/神经/胎传梅毒等。梅毒已连续多年位居我国甲乙类法定报告传染病病种的第3位，早已成为威胁全球健康的公共卫生问题。但人们对TP的研究相对较少。现有的对于TP的检测技术包括基于蛋白标志物的免疫分析方法(梅毒血清学试验、免疫组化/荧光)、基于基因组水平的聚合酶链式反应(PCR)、基于病原体的镜检(暗视野显微镜)及兔子感染实验等。现行技术的检测结果由于存在假阴/阳性、血清固定、主观判读、抗体非特异染色，荧光染料易淬灭、光漂白，无法实时跟踪等问题使其在梅毒的精确检测、指导临床治疗中受到局限；且TP与宿主细胞相互作用的可视化研究还相对缺乏，许多有机分子由于其平面的共轭结构使其在稀溶液中发光很强，但在高浓度溶液中或在聚集(纳米粒子、胶束、固体薄膜或粉末)状态下荧光变弱甚至完全消失，聚集导致猝灭(aggregation
‑
caused quenching,ACQ)荧光现象，另外还有光漂白、不利于长时间成像的问题。因此开发可靠、实时地对活TP的动态示踪成像技术具有重要的临床意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针及其制备方法与可视化标记策略，以解决现有技术中不能对活TP的示踪成像，缺乏TP与宿主细胞相互作用的可视化研究的问题。
[0004]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0005]本专利技术提供一种具有聚集诱导发光(Aggregation
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induced emission，AIE)特性的TP荧光标记探针，其结构式如下所示：
[0006][0007]本专利技术还提供一种所述的具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针的制备方法，步骤包括：将化合物1于干燥的CH2Cl2中溶解，冰浴情况下用BBr3处理反应，得化合物2；将化合物2、DBCO
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NHS和4
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二甲氨基吡啶溶于THF溶液中，加热搅拌，得到终产物DBCO
‑
TPE；
[0008]所述化合物1结构如式(Ⅰ)所示：
[0009][0010]所述化合物2结构如式(Ⅱ)所示：
[0011][0012]优选地，详细步骤包括：将化合物1于干燥的CH2Cl2中溶解，冰浴情况下用BBr3处理反应2h，加水猝灭反应并用CH2Cl2萃取、干燥、柱色谱提纯得化合物2，将化合物2、DBCO
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NHS和4
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二甲氨基吡啶溶于THF溶液中，并加热至40℃搅拌24h，除去溶剂并进行柱层析得到终产物二苯基环辛炔
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四苯乙烯DBCO
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TPE。
[0013]本专利技术还提供一种使用所述具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针标记的活TP的重悬培养基，所述重悬培养基是TPCM
‑
2培养基，其成分包括：不含谷胱甘肽的
CMRL1066、丙酮酸钠、刃天青、吗啉基丙磺酸、碳酸氢钠、谷酰胺、葡萄糖、组氨酸、二硫苏糖醇、灭活胎牛血清。
[0014]更优地，按TPCM
‑
2培养基体积为100mL计，所述TPCM
‑
2培养基成分包括：0.7mM丙酮酸钠、质量分数0.1％刃天青、1M吗啉基丙磺酸、质量分数7.5％碳酸氢钠、200mM谷酰胺、17.6mM葡萄糖、0.52mM组氨酸、0.52mM二硫苏糖醇、体积分数5
‑
20％灭活胎牛血清、不含谷胱甘肽的CMRL1066余量。
[0015]本专利技术还提供一种使用所述具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针的活TP可视化标记策略，步骤包括：先将TP与叠氮
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D
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丙氨酸孵育，使叠氮
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D
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丙氨酸通过肽聚糖代谢掺入到TP的肽聚糖骨架中；再将TP和DBCO
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TPE孵育，通过荧光标记探针二苯基环辛炔
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四苯乙烯DBCO
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TPE与叠氮
‑
D
‑
丙氨酸发生点击化学反应，实现对活TP的荧光标记。
[0016]更优地，详细步骤包括：于1.5mL EP管中将1mL 107条/mL TP菌液与终浓度250μM叠氮
‑
D
‑
丙氨酸于三气培养箱孵育48h；然后14000g离心5min沉淀TP，去除未利用的AzDA，再1mL PBS清洗离心，用终浓度10μM二苯基环辛炔
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四苯乙烯DBCO
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TPE与上述所得TP于34℃三气培养箱孵育15min，高速离心沉淀TP，1mL PBS清洗离心，用500μL TPCM
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2培养基重悬，实现对TP可视化标记。
[0017]本专利技术还提供具有聚集诱导发光(Aggregation
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induced emission，AIE)特性的TP荧光标记探针在制备用于活TP的示踪成像的药物中的应用。
[0018]本专利技术还提供具有聚集诱导发光(Aggregation
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induced emission，AIE)特性的TP荧光标记探针在制备用于活TP的示踪成像的试剂盒中的应用。
[0019]本专利技术的优点包括：利用肽聚糖代谢，通过生物正交反应，实现TP的可视化活体标记；另外，AIE探针具有聚集诱导发光特性，可解决传统荧光染料聚集诱导淬灭、光漂白、不利于长时间成像等问题。
附图说明
[0020]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0021]图1是具有聚集诱导发光特性的荧光探针实现活TP标记的策略示意图。
[0022]图2是DBCO
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TPE的质谱图。
[0023]图3是DBCO
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TPE的紫外吸收光谱图；
[0024]图4是在不同水/DMF比例介质中的DBCO
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TPE溶液的荧光强度图。
[0025]图5是TP的暗视野显微镜结果图。
[0026]图6是DBCO
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TPE与梅毒螺旋体孵育后的死活染色实验图。
[0027]图7是DBCO
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TPE对细胞的CCK8毒性结果图。
[0028]图8是DBCO
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TPE标记活梅毒螺旋体的实验结果图。
[0029]图9是DBCO
‑
TPE标记的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针，其特征在于：其结构式如下所示：2.一种如权利要求1所述的具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针的制备方法，其特征在于：步骤包括：将化合物1于干燥的CH2Cl2中溶解，冰浴情况下用BBr3处理反应，得化合物2；将化合物2、DBCO
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NHS和4
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二甲氨基吡啶溶于THF溶液中，加热搅拌，得到终产物DBCO
‑
TPE；所述化合物1结构如式(Ⅰ)所示：所述化合物2结构如式(Ⅱ)所示：3.如权利要求2所述的一种具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针的制备方法，其特征在于：详细步骤包括：将化合物1于干燥的CH2Cl2中溶解，冰浴情况下用BBr3处理反应2h，加水
猝灭反应并用CH2Cl2萃取、干燥、柱色谱提纯得化合物2，将化合物2、DBCO
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NHS和4
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二甲氨基吡啶溶于THF溶液中，并加热至40℃搅拌24h，除去溶剂并进行柱层析得到终产物二苯基环辛炔
‑
四苯乙烯DBCO
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TPE。4.一种使用权利要求1
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3任一所述具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针标记的活TP的重悬培养基，其特征在于：所述重悬培养基是TPCM
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2培养基，其成分包括：不含谷胱甘肽的CMRL1066、丙酮酸钠、刃天青、吗啉基丙磺酸、碳酸氢钠、谷酰胺、葡萄糖、组氨酸、二硫苏糖醇、灭活胎牛血清。5.如权利要求4所述一种使用具有聚集诱导发光特性的TP荧光标记探针标记的活TP的重悬培养基，其特征在于：按TPCM
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2培养基体积为100mL计，所述TPCM
‑
2培养基成分包括：0.7mM丙酮酸钠、质量分数0.1％刃天青、1M吗啉基丙磺酸、质量分数7.5％碳酸氢钠、200m...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉辉，郑举敦，杨斌，岳锐，江银波，林伟强，黄佳林，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：