一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路制造技术

本发明专利技术提供了一种用于高温胁迫条件下基因组甲基化的载体系统，能够快速实现DNA甲基化修饰水平变异，并且可以精确控制甲基化的时机和精确定位甲基化靶向基因的位点。该系统是包含了三个表达盒的表达载体。本发明专利技术用上述表达载体进行了水稻基因组甲基化的应用，获得了良好效果。良好效果。

【技术实现步骤摘要】
一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路

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[0001]本专利技术涉及一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控系统。

技术介绍
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[0002]基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段。随着基因编辑工具锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEs)以及CRISPR/Cas9系统的开发利用，通过靶定和修饰特异的基因组序列来研究基因功能的条件变得成熟。越来越多的研究将基因编辑工具用于表观遗传修饰以及基因调控。
[0003]DNA甲基化是表观遗传调控的重要方式，近年来逐渐揭示的DNA腺嘌呤甲基化(N6-Methyladenine，6mA)具有不同于其他表观遗传标记的调控模式，在响应环境信号、调控发育等多方面显示出重要作用，这些发现为作物提高产量和环境适应性提供了新的研究方向。已有研究发现，DNA 6mA修饰在高温胁迫中含量变化明显升高，直接参与胁迫诱导基因的表达调控。因此，在高温胁迫诱导条件下，利用表观编辑技术精确定位靶向抗逆基因，增加其DNA 6mA水平，有助于提高植物耐热性。构建高温智能响应型系统操纵植物在特定抗逆靶基因的甲基化，为创制智能适应性作物提供了可能。

技术实现思路
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[0004]本专利技术的目的是提供一种作物基因组精准甲基化载体系统。特别是提供一套用于高温胁迫条件下基因组甲基化的载体系统，能够快速实现DNA甲基化修饰水平变异，并且可以精确控制甲基化的时机和精确定位甲基化靶向基因的位点。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种包含了三个表达盒的表达载体，见如下：
[0006]表达盒1：DNA 6mA(DNA N6-Methyladenine)修饰元件，其目的是向目的基因DNA序列进行6mA修饰；
[0007]表达盒2：Cre-loxP基因开关系统，是在高温诱导条件下，介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。其目的是精准调控甲基化的启动时机。
[0008]表达盒3：SunTag基因靶向系统，是将多个拷贝的甲基化修饰因子挂到可用来靶向基因或其他的分子的蛋白质支架上，将甲基化修饰因子的生物活性显著放大。其目的是精确定位甲基化的位置。
[0009]所述表达盒1由SEQ ID NO:1所示的拟南芥熱激启动子启动功能片段甲表达；所述功能片段甲包括SEQ ID NO:2所示的剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)
[0010]所述表达盒2由SEQ ID NO:3所示的水稻U6启动子启动功能片段乙表达；所述功能片段乙包括SEQ ID NO:4所示的gRNA表达盒；
[0011]所述表达盒3由SEQ ID NO:5所示的水稻特异性Act1启动子启动功能片段丙表达；所述功能片段丙是如下各序列的组合：
[0012]SEQ ID NO:6所示的剪切酶Cre识别序列loxP；
[0013]SEQ ID NO:7所示的dCas9的编码序列；
[0014]SEQ ID NO:8所示的10个拷贝GCN4肽的编码序列；
[0015]SEQ ID NO:9所示的单链可变片段scFv的GCN4抗体；
[0016]SEQ ID NO:10所示的sfGFP的编码序列；以及
[0017]SEQ ID NO:11所示的DNA 6mA表观修饰因子N6AMT1基因。
[0018]本专利技术基因组DNA甲基化的方法包括如下步骤：将前文所述的表达载体导入受体作物，实现作物基因组特定位点DNA甲基化。
[0019]但是，本专利技术的表达载体并不限于仅应用于水稻，本专利技术的设计理念可以应用于其他作物。在应用中，或许需要更换部分适用于具体作物的载体序列，例如更换合适的启动子。但是，无论何种更换，均属于本专利技术的专利技术思路和专利技术精神。
[0020]本专利技术用上述提供的表达载体进行了水稻基因组甲基化的应用，获得了良好效果，具体数据详见实施例。
[0021]所述水稻基因组DNA甲基化发生在水稻细胞核内。
[0022]调控模式图如图2所示。
附图说明：
[0023]图1为载体结构示意图。
[0024]图2为环境智能响应型表观遗传调控模式图。
[0025]图3为水稻原生质体瞬时转化载体利用共聚焦显微镜观察GFP荧光蛋白。
[0026]图4为目的载体转化水稻原生质体后利用Dot Blot检测DNA 6mA水平变化。
[0027]图5为目的载体转化水稻原生质体利用LC/MS检测DNA 6mA水平变化。
[0028]图6为目的载体转化水稻得到的转化体耐高温胁迫能力。
[0029]序列信息:
[0030]SEQ ID NO:1拟南芥熱激启动子pHSFA2序列(2000bp)。
[0031]SEQ ID NO:2剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)。
[0032]SEQ ID NO:3水稻OsU6启动子序列(447bp)。
[0033]SEQ ID NO:4Guide RNA Scaffold序列(76bp)。
[0034]SEQ ID NO:5水稻组成型启动子pActin1序列(1401bp)。
[0035]SEQ ID NO:6剪切酶Cre识别序列loxP(34bp)。
[0036]SEQ ID NO:7失活Cas9蛋白(dCas9)编码核苷酸序列(4104bp)。
[0037]SEQ ID NO:8 10xGCN4单体肽核酸编码核苷酸序列(1233bp)。
[0038]SEQ ID NO:9单链抗体ScFV编码核苷酸序列(831bp)。
[0039]SEQ ID NO:10sfGFP荧光蛋白编码核苷酸序列(711bp)。
[0040]SEQ ID NO:11DNA表观修饰因子(GOI:N6AMT1)基因编码序列(645bp)。
具体实施方式:
[0041]实施例1目的载体在水稻原生质体的瞬时表达
[0042]1、目的载体的构建
[0043]根据已公布的拟南芥基因组序列，设计特异性PCR引物从拟南芥基因组扩增得到SEQ ID NO:1的所示的拟南芥熱激启动子pHSFA2片段；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的各序列以质粒pKEY、pLY(参考文献：DOI:10.1038/s41598-017-14679-0)为模板通过PCR扩增得到；SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:10所示的序列以质粒(Addgene#106437)为模板通过PCR扩增得到；SEQ ID NO:11所示的序列为合成所得；各片段经过组装连接在pSB1300载体骨架上，得到如图1所示的目的载体。
[0044]2、水稻叶鞘原生质体的制备及转化后熱激处理
[0045]2.1配制以下溶液：
[0046]100mM M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种作物基因组甲基化载体系统，包含以下三个表达盒的表达载体：表达盒1：由SEQ ID NO:1所示的启动功能片段甲表达；所述功能片段甲包括SEQ ID NO:2所示的剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)；表达盒2：由SEQ ID NO:3所示的启动功能片段乙表达；所述功能片段乙包括SEQ ID NO:4所示的gRNA表达盒；表达盒3由SEQ ID NO:5所示的启动功...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷晓峰，胡桂花，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：