紫花苜蓿CRISPR/Cas9多靶点编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了紫花苜蓿CRISPR/Cas9多靶点编辑系统及其应用。本发明专利技术提供了一种用于紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组多靶点编辑的表达载体，包括三个sgRNA表达盒，三个sgRNA表达盒中启动子分别为MsU6‑d1promoter(SEQ ID No.1的第1‑500位)、MsU6g1promoter(SEQ ID No.1的第789‑1317位)和MsU6‑d3promoter(SEQ ID No.1的第1606‑2095位)，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述sgRNA3可针对紫花苜蓿的同一靶标基因或不同靶标基因。本发明专利技术根据紫花苜蓿同源四倍体的特点设计三个靶点，靶向同一基因或不同基因，本发明专利技术这种优化的基因组编辑系统大大提高了紫花苜蓿基因编辑效率，植株基因编辑效率可达42.9％，双靶点共编辑效率可达14.3％，三靶点共编辑效率可达7.1％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，具体涉及紫花苜蓿crispr/cas9多靶点编辑系统及其应用。

技术介绍

1、紫花苜蓿(medicago sativa)是豆科苜蓿属多年生饲草作物，因其适应性广，产草量高，草质优良，富含粗蛋白，营养丰富，适口性好，被誉为“牧草之王”。除了具有优异的饲用价值，紫花苜蓿栽培对于草地生态的保护和维持也具有重要作用。因此，紫花苜蓿的生理生态研究和遗传育种工作具有重要意义。但是，紫花苜蓿栽培种多为自交不亲和、异花授粉的同源四倍体，基因组庞大而复杂，因此紫花苜蓿的基础研究和育种工作存在很大难度。

2、crispr/cas9技术是新兴的基因组定点编辑技术，主要包括向导rna(sgrna)和核酸酶cas9蛋白。融合靶点序列的sgrna可与基因组序列互补配对，介导cas9蛋白对靶点位置进行切割，造成双链断裂，引发机体的dna修复，在修复过程中引入随机突变，从而实现靶标基因的定点编辑。紫花苜蓿基因编辑技术虽然已有报道，但其编辑效率尚不能满足实际应用的需要。具体来说，最早由蒺藜苜蓿mtu6-1启动子驱动的单个sgrna所介导的蒺藜苜蓿基因编辑系统本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组多靶点编辑的表达载体，其特征在于：所述表达载体包括sgRNA1表达盒、sgRNA2表达盒和sgRNA3表达盒；

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述sgRNA1表达盒、所述sgRNA2表达盒和所述sgRNA3均含有名称为AtU6-26t的终止子；

3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于：所述sgRNA1表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-788位所示；和/或

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为含有SEQ IDNo.1所示DNA片段的环形质粒。...

【技术特征摘要】

1.一种用于紫花苜蓿crispr/cas9基因组多靶点编辑的表达载体，其特征在于：所述表达载体包括sgrna1表达盒、sgrna2表达盒和sgrna3表达盒；

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述sgrna1表达盒、所述sgrna2表达盒和所述sgrna3均含有名称为atu6-26t的终止子；

3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于：所述sgrna1表达盒的核苷酸序列如seq id no.1的第1-788位所示；和/或

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为含有seq idno....

【专利技术属性】
技术研发人员：牛丽芳，夏秀芝，王娜，林浩，张鹏程，祝步拓，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：