通过使用GRF1加强基因实现的增强的植物再生及转化制造技术

本发明专利技术涉及植物育种以及生物技术领域，尤其涉及从细胞以及其它组织产生植物。更具体而言，本发明专利技术提供了用于改善特别是来自使用GRF1加强基因的转化的或遗传修饰的植物细胞的植物再生的方法及工具。物再生的方法及工具。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过使用GRF1加强基因实现的增强的植物再生及转化
[0001]本专利技术涉及植物育种以及生物
，尤其涉及从细胞以及其它组织产生植物。更具体而言，本专利技术提供了用于改善特别是来自转化的或遗传修饰的植物细胞的植物再生的方法及工具。
[0002]在植物育种中，为了形成用于特定目的的所需基因型及表型，自接近人类文明开始以来就已经实践了植物物种的操纵过程。随着基因工程的发展，近几十年来，这一农业领域发生了重大变化。已经开发出了用于植物基因工程的各种方法。转化方法的选择取决于许多变量，主要是要转化的植物物种、实验目的以及必需设备的可用性。大多数植物转化技术需要使用具有高再生能力的外植体作为起始材料。另外，基因编辑构成了一种新的分子生物学方法，通过该方法可以将诸如插入、缺失或点突变或其组合之类的特异性修饰引入植物的基因组中。为此，需要特异性分子工具，其首先具有核酸酶活性，但最重要的是可以以足够的特异性引导至待修饰的靶序列以编程并进行特异性的定点诱变。在过去几年中，在植物生物技术中，特异性基因组编辑已经发展成为常规育种以及转基因策略的替代。然而，由于植物的经编辑的起始材料的再生能力有限，因此目前可获得的工具，诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、“转录激活因子样效应物核酸酶”(TALEN)或CRISPR系统，仅在有限程度上用于植物生物技术中。
[0003]多种细胞具有发育成胚的潜力，包括单倍体配子体细胞，诸如花粉及胚囊的细胞(参见Forster,B.P.等(2007)Trends Plant Sci.12:368
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375以及Segu
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Simarro,J.M.(2010)Bot.Rev.76:377
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404)以及衍生自植物的所有三个基本组织层的体细胞(Gaj,M.D(2004)Plant Growth Regul.43:27
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47或Rose,R.等(2010)在Plant Developmental Biology
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Biotechnological Perspectives中的“Developmental biology of somatic embryogenesis”，Pua E
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C以及Davey MR编辑(Berlin Heidelberg:Springer)，第3
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26页)。
[0004]再生为植物的能力通常限于某些植物物种中的特定基因型，并且在转化以及遗传修饰的植物细胞及其它前体组织中减弱。即使植物细胞的转化及遗传修饰步骤是成功的，这并不一定意味着实际上可以从所修饰的细胞获得所需植物。假定为了实现遗传修饰而使植物细胞及其它前体组织经受的处理影响植物发育及再生。因此，本专利技术的目的是提高先前已知的用于产生转基因及遗传修饰植物的方法的功效，并支持从修饰的植物细胞及其它植物前体再生植物。
[0005]Lowe K等(2016,“形态形成调节因子Baby boom及Wuschel提高单子叶植物转化(Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation)”Plant Cell 28:1998
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2015.)报道了一种利用形态形成基因产生有助于转化效率的生物学背景的转化方法。它们的转化构建体包括玉米(玉蜀黍)Baby boom(BBM)以及Wuschel2(WUS2)。作者将这些构建体用于来自四个玉米自交系的未成熟胚的农杆菌介导的转化。这些系表现出明显较高的转化率，从对照中的0％至2％到在WUS2及BBM存在下的25％至51％。然而，该方法具有缺点并且通常不适用，因为构成性表达ZmWUS2以及ZmBBM的植物通常是不育的或甚至致死的。因此，希望有一种用于提高转化及再生效率的方法，该方法会导致不显示可识别的表型的植物。
[0006]在van der Knaap等(2000；“来自水稻的新型赤霉素诱导基因以及它在茎生长中的潜在调节作用(A novel gibberellin
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induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth)”，Plant physiology，122(3)，695
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704.)中，作者已经鉴定并表征了水稻中的GRF基因家族的第一成员(OsGRF1)。这是居间分生组织中的赤霉酸诱导基因。拟南芥中的过表达导致茎生长受损、雌性不育以及雄性能育性降低。施用赤霉酸无法恢复转化植物的茎伸长缺陷，表明OsGRF1可以参与GA诱导的茎伸长。在2003年，Kim等(“推定转录因子的AtGRF家族参与拟南芥中的叶子以及子叶生长(The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis)”，The Plant Journal，36(1)，94
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104.)已经表征了拟南芥GRF家族并确定了基因主要在活跃生长的组织中表达。对过表达At GRF1以及AtGRF2的无效突变体及转基因植物的分析表明，GRF家族的一些成员参与在叶子以及子叶生长期间的细胞扩增的调节。另外，过表达植物显示出延迟的抽苔时间，揭示了在开花中的推定作用。在确定协调正在发育的叶子中的细胞增殖的分子机制的研究中，Rodriguez等发现miR396在拟南芥中拮抗其靶标GRF转录因子的表达模式((2010)，“Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396”，Development，137(1)，103
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112.)。因此，miR396与GRF之间的平衡控制叶子中的细胞的最终数目。此外，作者显示出miR396靶向的GRF可以调节茎尖分生组织的大小。
[0007]Kuijt等(2014，“Interaction between the GROWTH
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REGULATING FACTOR and KNOTTED1
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LIKE HOMEOBOX Families of Transcription Factors”，Plantphysiology，164(4)，1952
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1966.)显示出GRF家族的成员在控制参与茎尖分生组织中细胞分化的限制的KNOTTED1
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LIKE HOMEBOX(KNOX)基因的表达的网络中充当参与者。AtGRF4、AtGRF1以及AtGRF6能够结合KNOX基因的启动子，从而抑制其表达。过表达AtGRF4、AtGRF1或AtGRF6的拟南芥幼苗在茎尖分生组织中表现出发育畸变。
[0008]Nelissen H等(2015，“ANG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于转化植物细胞的方法，包括以下步骤：(a1)平行或依次向植物细胞中引入i.至少一个感兴趣的核苷酸序列；以及ii.包含编码GRF1多肽的多核苷酸的表达盒，编码GRF1多肽的mRNA，或GRF1多肽；或(a2)向植物细胞中引入至少一个感兴趣的核苷酸序列；并且在所述植物细胞中平行或依次诱导编码GRF1多肽的内源基因的增强的表达水平；以及(b)任选地，在以下条件下培育(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞：其中在所述植物细胞中，所述GRF1多肽从所述表达盒表达，GRF1多肽从引入的mRNA翻译，GRF1多肽从所述内源基因增强表达，或存在GRF1多肽。2.一种用于修饰植物细胞的基因组的方法，包括以下步骤：(a1)向植物细胞中引入包含编码GRF1多肽的多核苷酸的表达盒，编码GRF1多肽的mRNA或GRF1多肽；或(a2)在植物细胞中诱导编码GRF1多肽的内源基因的增强的表达水平；以及(b)在以下条件下培育(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞：其中在所述植物细胞中，所述GRF1多肽从所述表达盒表达，GRF1多肽从引入的mRNA翻译，GRF1多肽从所述内源基因增强表达，或存在GRF1多肽；(c)通过单链DNA断裂(SSB)或双链DNA断裂(DSB)诱导酶或碱基编辑酶以及任选地通过修复核酸分子修饰(b)的植物细胞的基因组，所述SSB或DSB诱导酶或所述碱基编辑酶优选识别所述细胞的基因组中的预定位点，其中所述基因组在所述预定位点处的修饰选自i.至少一个核苷酸的取代；ii.至少一个核苷酸的缺失；iii.至少一个核苷酸的插入；或iv.i.
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iii.的任何组合；以及其中步骤(c)与步骤(a1)/(a2)和/或(b)同时进行，在步骤(a1)/(a2)之前进行，在步骤(a1)/(a2)与(b)之间进行或在步骤(b)之后进行。3.一种产生转基因植物的方法，包括以下步骤：(a)根据权利要求1所述的方法转化植物细胞，以及(b)从(a)的植物细胞或从衍生自(a)的植物细胞的植物细胞再生包含至少一个细胞的植物，所述至少一个细胞包含作为转基因的至少一个感兴趣的核苷酸序列。4.一种产生遗传修饰的植物的方法，包括以下步骤：(a)根据权利要求2的方法修饰植物细胞的基因组，以及(b)从(a)的植物细胞或从衍生自(a)的植物细胞的植物细胞再生在至少一个细胞中包含所述基因组的修饰的植物。5.一种产生单倍体植物胚的方法，包括以下步骤：(a1)将包含编码GRF1多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF1多肽的mRNA或GRF1多肽引入未成熟的雄性配子体或小孢子中；或(a2)在未成熟的雄性配子体或小孢子中诱导编码GRF1多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(c)在以下条件下培育(a)的未成熟的雄性配子体或小孢子：其中在所述未成熟的雄性配子体或所述小孢子中，所述GRF1多肽从所述表达盒表达，GRF1多肽从引入的mRNA翻译，GRF1多肽从所述内源基因增强表达，或存在GRF1多肽；以及(d)选择衍生自步骤(b)的所述未成熟的雄性配子体或所述小孢子的单倍体植物胚。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述GRF1多肽包含PFAM结构域PF08880以及PFAM结构域PF08879，优选地其中所述PFAM结构域PF08880在所述GRF1多肽的N末端处或附近发现至少90％覆盖率的匹配，并且所述PFAM结构域PF08879在位于所述GRF1多肽中的所述PFAM结构域PF08880的C末端处发现至少90％的匹配。7.权利要求6的方法，其中两个匹配的氨基酸段均位于所述GRF1多肽的N末端一半。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述GRF1多肽包含的基序[D]
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[P]
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[E]

【专利技术属性】
技术研发人员：孔吉祥，D，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：