核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法技术

本发明专利技术属于植物分子生物学和农业生物技术领域，具体涉及核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，包括：将受E2调控的携带有花粉致死基因的筛选标记基因表达盒E1；花粉特异性调控表达盒E2；胚自主发生基因表达盒E3，经孤雌生殖得不含筛选标记的无性胚；创制MiMe突变体的基因编辑表达盒E4同时导入植物。E2调控基因表达，删除E1中识别位点之间的元件，调控筛选标记基因的表达，获得带有筛选标记的活性花粉，当识别无效时，花粉致死基因表达，使不带有筛选标记的花粉失活。本发明专利技术能在杂种后代中高效分选出固定了杂种优势的种子，并达到杂种优势利用一系法的产业化要求。势利用一系法的产业化要求。势利用一系法的产业化要求。

【技术实现步骤摘要】
核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法


[0001]本专利技术属于植物分子生物学和农业生物
，具体涉及一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种引物，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，以及一种筛选无融合生殖系的方法。

技术介绍

[0002]一个完整的植株包括孢子体世代(2n)，它具有特定的生殖结构(花器官)，其中的雌蕊、雄蕊经过减数分裂和遗传重组，分别产生大孢子(1n)和小孢子(1n)；大、小孢子经过几次有丝分裂形成雌、雄配子体，雌配子体(胚囊)含有7个细胞(1个卵细胞、2个助细胞、1个具2核的中央细胞、3个反足细胞)并深埋于母体的胚珠组织中，雄配子体(花粉)含有1个营养细胞和2个精子；传粉后，花粉管进入胚囊，发生双受精作用，其中一个精子(雄配子)和卵细胞(雌配子)结合形成合子胚(2n)，另一个精子和中央细胞结合形成胚乳(3n)，由此完成一个生活周期，并开始新一轮孢子体世代。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子包含表达盒E1，所述表达盒E1携带有筛选标记基因和花粉致死基因，所述表达盒E1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活；优选的，所述表达盒E1自上游至下游包括如下元件：胚特异表达启动子、第一调控位点、第一终止子、花粉特异表达启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子；其中，所述第一调控位点和第二调控位点的设置使得能够被识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件；优选的，所述胚特异表达启动子选自OsESP1、Ole18、OsVP1P和ZmESP，优选为OsESP1启动子，其序列优选如SEQ ID NO.2所示；优选的，所述第一调控位点选自重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；更优选的，所述第一调控位点自上游至下游为重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点，进一步优选为LoxP/FRT融合位点和双链断裂诱导酶I-SceI位点；更进一步优选的，所述LoxP/FRT融合位点的序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述双链断裂诱导酶的序列如SEQ ID NO.4所示；优选的，所述第一终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；优选的，所述花粉特异表达启动子为PG47；所述PG47启动子的序列优选如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.23所示；优选的，所述花粉致死基因选自ZmAA1和Barnase，优选为ZmAA1，更优选的，所述ZmAA1基因的序列如SEQ ID NO.7所示；优选的，所述第二终止子为IN2-1终止子，所述IN2-1终止子的序列优选如SEQ ID NO.8所示；优选的，所述第二调控位点选自重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；更优选的，所述第二调控位点自上游至下游为双链断裂诱导酶识别位点和重组酶识别位点，进一步优选为双链断裂诱导酶I-SceI位点和LoxP/FRT融合位点；更进一步优选的，所述LoxP/FRT融合位点的序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述双链断裂诱导酶如SEQ ID NO.4所示；优选的，所述筛选标记基因为荧光蛋白编码基因，优选为红色荧光蛋白编码基因，更优选为红色荧光蛋白基因DsRed2，所述DsRed2的序列优选如SEQ ID NO.9所示；优选的，所述第三终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；优选的，所述表达盒E1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；优选的，该核酸分子还包含表达盒E2，所述表达盒E2携带有调控基因，该调控基因能够识别所述第一调控位点和第二调控位点并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件；优选的，所述表达盒E2自上游至下游包括如下元件：花粉特异表达启动子、调控基因和第四终止子；优选的，所述花粉特异表达启动子为PG47；所述PG47启动子的序列优选如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.23所示；优选的，所述调控基因选自重组酶系统、双链断裂诱导酶系统、基因组编辑系统和转座
子系统，优选为重组酶系统，更优选为重组酶编码基因Cre，进一步优选的，重组酶编码基因Cre的序列如SEQ ID NO.11所示；优选的，所述第四终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；优选的，所述表达盒E2包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；优选的，该核酸分子还包含表达盒E3，所述表达盒E3携带有胚自主发生基因；优选的，所述表达盒E3自上游至下游包括如下元件：卵细胞特异启动子、胚自主发生基因和第五终止子；优选的，所述卵细胞特异启动子选自AtDD45、Os03g0296600pro、ECA1-like1 pro、DCL2、AT1G74480.1和ZmEAlpromoter；优选为AtDD45，AtDD45的序列优选如SEQ ID NO.13所示；优选的，所述胚自主发生基因选自BBM1、WUS、LEC、CLAVATA和MYB115，优选为BB...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹孟良，夏玉梅，余木兰，唐宁，詹祎捷，淡俊豪，卜小兰，王耀，石跃斌，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：