一种CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途及方法技术

本发明专利技术涉及IL

【技术实现步骤摘要】
一种CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途及方法


[0001]本专利技术涉及IL-2活性检测领域，特别是涉及一种CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途及方法。

技术介绍

[0002]目前的IL-2活性检测，报道最多的是基于CTLL-2细胞(1640培养基+胎牛血清的培养体系)来进行检测，该体系下它对人IL-2的反应性良好。这种方法我们暂且称之为“通用的IL-2活性检测法”。该方法也被写入了2015年药典《3524重组人白介素-2生物学活性测定法》
[0003]肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的治疗模式，也是当前认为最有效的一种治疗方式。目前，免疫治疗技术CAR-T细胞对多种血液肿瘤显示了非常好的临床效果，对实体瘤治疗也表现出了非常大的潜力。CAR-T技术通过体外对T细胞进行改造、扩增，然后回输给病人进行治疗。体外扩增多为CAR-T培养基+人血清的培养体系，在扩增阶段，IL-2是非常重要的一种外源添加因子，用于刺激T细胞增殖。IL-2的添加数量与CART细胞的收获时间、产品的质量息息相关。因此，适用于CAR-T培养基体系的反应性良好的IL-2的活性检测方法的建立就显得非常重要。例如：IL-2在CAR-T培养基中的稳定性研究；IL-2在CAR-T工艺不同阶段的活性变化研究等，这些都是工艺开发时的重要研究点。
[0004]通用IL-2活性检测法《3524》中，先用RPMI1640基础培养体系大比例稀释待测样本至IL-200IU/ml作为起始浓度点，进行检测(大比例稀释可以消除样本原有基质对检测的干扰，若有)。然而，基于CAR-T工艺参数，我们预估CAR-T培养基中IL-2的浓度为0-500IU/ml。IL-2过低，不利于细胞增殖速率提升，细胞增殖慢；IL-2过高，往往会导致Treg细胞比例增大，从而不利于CAR-T杀伤功能实现。因此，CAR-T工艺培养基中IL-2浓度无法大比例稀释(例如:>10倍的稀释)来降低基质本身潜在干扰，因为稀释前的浓度已经接近通用IL-2活性检测法中要求的起点浓度水平。CAR-T培养基(X-vivo培养基)是优化后的利于人T淋巴细胞生长的培养基，若不能大比例稀释，在不稀释的情况下参照药典《3524》方法的其他步骤，在测试孔分别加入100ul细胞(RPMI1640培养基)和100ul待测物(CART培养基)，就面临测试系统里面含有CAR-T培养基比例较高对分析造成未知干扰，无法准确测定IL-2活性的问题，此外，CTLL-2细胞应用于检测IL-2活性时，还存在细胞复苏时耗时长，细胞状态恢复慢，难复苏的问题。因此，我们认为需要建立一种反应良好且适用于CAR-T培养基体系的IL-2的活性检测方法。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测IL-2的方法，用于解决现有技术中CTLL-2细胞复苏时耗时长和CART培养基在通用IL-2活性的检测存在潜在干扰的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于CAR-T工艺各阶段培养基中IL-2的活性检测的用途。
[0007]在一实施例中，将经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于CAR-T培养时，培养基中IL-2的活性检测。
[0008]在一实施例中，CAR-T细胞培养时，培养基中IL-2的浓度大于或等于100IU/ml且小于200IU/ml。
[0009]本专利技术还提供一种IL-2的活性检测方法，包括以下步骤：
[0010]1)以CAR-T基础培养基为稀释液，配制不同浓度的IL-2标准样品溶液；
[0011]2)以CAR-T基础培养基为稀释液，配制不同浓度的待测样品溶液；
[0012]3)将复苏的经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞分别与各不同浓度的标准样品溶液和各不同浓度的待测样品溶液混合，并在适合CTLL-2细胞生长的环境下同时孵育；
[0013]4)显色并检测吸光度；
[0014]5)计算待测样品IL-2的相对活性。
[0015]在一实施例中，所述步骤3)中所述CTLL-2的细胞活率大于85％。
[0016]在一实施例中，所述步骤5)具体包括：分别读取标准药品曲线和待测样本曲线中半数抑制效应的IL-2活性浓度，计算待测样品的相对活性。
[0017]在一实施例中，驯化的所述CTLL-2细胞由包括以下步骤的方法制得：逐代提高CAR-T培养基在CTLL-2细胞混合培养基中占有的体积比，直至CAR-T培养基在所述CTLL-2细胞培养基中的体积占比为100％，所述CTLL-2细胞被驯化培养5-8代。
[0018]在一实施例中，所述CAR-T培养基在所述CTLL-2细胞培养基中占有的体积比，每代次提高为10-20％。
[0019]在一实施例中，所述CTLL-2细胞培养基中含有供CTLL-2细胞生长的IL-2。
[0020]在一实施例中，所述CTLL-2细胞在驯化传代时的接种密度是1～3*105cells/ml。
[0021]在一实施例中，所述CTLL-2细胞的密度为0.8～1.6*106cells/ml时收获。
[0022]在一实施例中，所述CTLL-2细胞在驯化时的培养条件是温度35℃～37℃，4～6％CO2。
[0023]在一实施例中，在步骤3)中，将复苏的经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞进行洗涤，再用CAR-T基础培养基稀释。
[0024]如上所述，本专利技术的一种检测IL-2的方法，具有以下有益效果：驯化后的CTLL-2细胞适用于CAR-T培养基中IL-2活性的检测，避免了在通用IL-2活性检测法《3524》中存在两种培养基混合导致的检测干扰，具有很好的准确度和重复性。没有被CAR-T培养基驯化后的CTLL-2细胞的复苏时耗时长，细胞状态恢复慢，难以复苏，驯化后的CTLL-2细胞复苏耗时短，状态恢复更快，节省了IL-2的活性检测时间。
附图说明
[0025]图1显示为CTLL-2细胞复苏后生长倍增时间曲线图。
[0026]图2显示为IL-2的不同相对活性点的准确度示意图。
[0027]图3显示为测定结果的平均值的线性拟合图。
[0028]图4显示为不同浓度IL-2的曲线的汇总。
具体实施方式
[0029]本专利技术首先提供一种经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途。
[0030]本专利技术提供的经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞适用于各种含有IL-2的样本中IL-2的活性检测，尤其适用于CAR-T细胞培养时，培养基中IL-2的活性检测。
[0031]在CAR-T培养时，培养基中的IL-2的浓度通常在0-500IU/ml，经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞适用于CAR-T细胞培养各阶段，培养基中IL-2的活性检测。当IL-2浓度低于200I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：将经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于CAR-T细胞培养时，培养基中IL-2的活性检测。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：CAR-T细胞培养时，培养基中IL-2的浓度范围是大于或等于100IU/ml且小于200IU/ml。4.一种IL-2的活性检测方法，包括以下步骤：1)以CAR-T基础培养基为稀释液，配制不同浓度的IL-2标准样品溶液；2)以CAR-T基础培养基为稀释液，配制不同浓度的待测样品溶液；3)将复苏的经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞分别与各不同浓度的标准样品溶液和各不同浓度的待测样品溶液混合，并在适合CTLL-2细胞生长的环境下同时孵育；4)显色并检测吸光度；5)计算待测样本中IL-2的相对活性。5.根据权利要求4所述的一种检测IL-2的方法，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：所述步骤3)中所述CTLL-2的细胞活率大于85％；所述步骤5)具体包括：分别读取标准药品曲线和待测样本曲线中半数抑制效应的IL-2活性浓度，计算待测样品的相对活性。6.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：程尹，韩洪坤，黄加保，
申请(专利权)人：上海药明巨诺生物医药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：