一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组及检测方法，属于植物病害的分子生物学检测领域。LAMP引物组包括一对外引物，一对内引物和一条环引物，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组及检测方法


[0001]本专利技术属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组及检测方法。

技术介绍

[0002]草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragariae)隶属于线虫门，侧尾腺纲，滑刃目，滑刃亚目，滑刃科，滑刃亚科，滑刃属。是一种叶和芽寄生线虫，可侵染多种农作物和观赏植物，是我国检疫性有害生物。
[0003]草莓滑刃线虫可危害重要的经济作物草莓，不直接侵入到植物的组织内，外寄生取食草莓的生长点，造成叶片皱缩、扭曲，常叶片小；线虫的取食活动可引起草莓果芽减少，导致草莓的产量减低，引起草莓春矮病。据德国开展的试验报道，该线虫危害草莓可造成产量损失高达45％。在俄罗斯莫斯科地区，草莓滑刃线虫与细菌复合侵染时，可影响草莓产量损失达28.6
‑
38％。
[0004]草莓滑刃线虫隶属于滑刃属，该属有100余种。但草莓滑刃线虫及其近似种的形态特征极其相似，传统的形态学鉴定方法很难区分。如A.besseyi、A.pswudolesistus、A.oryzae、A.olesistus等都曾在一段时间内被认为是草莓滑刃线虫的同物异名。
[0005]目前，草莓滑刃线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为主，必要时辅以分子生物学方法开展。但常规的特异引物PCR方法对设备要求高：需PCR仪、凝胶电泳仪等设备。环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比，LAMP不需要PCR仪，扩增产物通过肉眼观察或浊度仪即可判定结果，适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。
[0006]因此，建立一种草莓滑刃线虫的LAMP检测方法，以期能够快速、准确、灵敏、无污染的检测该线虫，是十分迫切和必要的。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组；本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种草莓滑刃线虫的LAMP检测方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0009]一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组，包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.5所示。
[0010]具体如下：
[0011]Af
‑
F3：ACACCTTGTTTGAGATCTTCT；
[0012]Af
‑
B3：CGCCACATCGGGTCATT；
[0013]Af
‑
FIP：AACCCAAAATAGCCGTTTCAAGTAACAGACTAGCAAGTGC
[0014]TATGC；
[0015]Af
‑
BIP：GAGTAGTTGTCTAGTTCGTGACTACTAGAATCAAGCCAA
[0016]TAGAGCGA；
[0017]Af
‑
LF：TTTTTCAAGTATTGTGTATTGAGAAG。
[0018]外引物Af
‑
F3/Af
‑
B3、内引物Af
‑
FIP/Af
‑
BIP能够针对草莓滑刃线虫的基因上的6个区域进行识别扩增，分别位于3
′
端的F3c区段，F2c区段，F1c区段和5
′
端的B1区段，B2区段，B3区段。通过增加一条环引物Af
‑
LF促进LAMP反应，提升反应速率，缩短反应时间。
[0019]所述的LAMP引物组能够快速检测植物组织样品中是否含有草莓滑刃线虫。
[0020]同时，所述的LAMP引物组能够快速检测混合线虫样品中是否含有草莓滑刃线虫。
[0021]其他植物线虫包括菊花滑刃线虫、次薄滑刃线虫、松材线虫、拟松材线虫、湖南剑线虫、雪松毛刺线虫、奇氏拟鞘线虫、卢斯短体线虫、长岭发垫刃线虫、旱稻孢囊线虫、花生根结线虫、腐烂茎线虫、鳞球茎茎线虫、柑橘半穿刺线虫、肾状肾形线虫、深圳针线虫。
[0022]一种快速检测草莓滑刃线虫的试剂盒，试剂盒中包括所述的LAMP引物组，也在本专利技术的保护范围内。
[0023]一种草莓滑刃线虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：
[0024]1)以待测样品的DNA为模板利用所述的LAMP引物组进行LAMP扩增；
[0025]其中，LAMP扩增的反应体系为：2μL待测样品的DNA模板、LAMP引物组中每条引物各1μL、反应酶1μL、RM 12.5μL，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μL；
[0026]LAMP扩增的反应条件为：62℃恒温反应60min；80℃灭活5min结束反应。
[0027]2)根据扩增结果判断待测样品中是否含有草莓滑刃线虫；
[0028]分别以实时浊度仪和目视浊度法观察检测反应管内的浊度情况判断是否产生特异性扩增。
[0029]若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有草莓滑刃线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有草莓滑刃线虫。
[0030]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0031]1)快速、便捷。本专利技术只需要60min即可完成LAMP反应，而且对仪器设备要求低，不需要PCR仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测；
[0032]2)特异性强。本专利技术只能够特异地扩增草莓滑刃线虫，供试其它植物线虫均未发生扩增，具有物种特异性；
[0033]3)灵敏度较高。检测灵敏度为1/500条线虫；
[0034]4)步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增；
[0035]5)结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察浊度就能够判断扩增与否，实现了结果可视化，还可采用实时浊度仪等方法判定；
[0036]6)对人和环境安全，检测过程不需要使用EB等有毒试剂。
附图说明
[0037]图1为LAMP特异性检测LA
‑
320C柱状图；图中，Block A中1
‑
8号样本分别为草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：芍药；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：铃兰；来源：荷兰)；草莓滑刃线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物
材料：独尾草；来源：荷兰)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：蒲公英；来源：意大利)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；Block B中1
‑
8号样本分别为菊花滑刃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测草莓滑刃线虫的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.5所示。2.权利要求1所述的LAMP引物组在快速检测植物组织样品中是否含有草莓滑刃线虫中的应用。3.权利要求1所述的LAMP引物组在快速检测混合线虫样品中是否含有草莓滑刃线虫中的应用。4.一种快速检测草莓滑刃线虫的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括权利要求1所述的LAMP引物组。5.一种草莓滑刃线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组进行LAMP扩增；2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞禄珍，宋绍禕，李帅，田沂民，王一椒，李丽，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：