基于分子定量技术检测守宫特异片段拷贝数对金龙胶囊进行质量控制的方法及引物和探针技术

本发明专利技术公开了基于分子定量技术检测守宫特异片段拷贝数对金龙胶囊进行质量控制的方法及引物和探针。包括：根据守宫正品原动物无蹼壁虎与其混伪品线粒体基因组序列差异，设计合成特异性引物和探针；提取金龙胶囊合格品的DNA，通过qPCR或ddPCR确定金龙胶囊合格品中无蹼壁虎特异片段的拷贝数范围；提取待检测金龙胶囊样品的DNA进行qPCR或ddPCR，计算无蹼壁虎特异片段的拷贝数；与合格品比对。本发明专利技术以qPCR或ddPCR测得的无蹼壁虎特异片段的拷贝数作为质控检测指标，通过对比待检测金龙胶囊中特异片段的拷贝数与合格品的拷贝数范围，考察金龙胶囊的质量。该方法可快速、灵敏地特异性检测金龙胶囊中守宫组分及含量。检测金龙胶囊中守宫组分及含量。检测金龙胶囊中守宫组分及含量。

【技术实现步骤摘要】
基于分子定量技术检测守宫特异片段拷贝数对金龙胶囊进行质量控制的方法及引物和探针


[0001]本专利技术涉及动物中成药质量控制
，具体涉及一种基于分子定量技术检测守宫特异片段拷贝数对金龙胶囊进行质量控制的方法及引物和探针。

技术介绍

[0002]金龙胶囊由2:1:1的鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇组成，是国家首例批准的以鲜药用动物组方制备的癌症用药，具有破瘀散结、解郁通络的功效，主要用于原发性肝癌血瘀郁结证、症见右胁下积块、胸胁疼痛、神疲乏力、腹胀、纳差等。壁虎是蜥蜴亚目(Sauria)壁虎科(Gekkonidae)所有蜥蜴的通称，又称作天龙、守宫。现代研究发现，壁虎具有抗肿瘤活性，可以用于治疗恶性肿瘤、中风瘫痪等疑难杂症。金龙胶囊中所使用的鲜守宫，其来源为无蹼壁虎。由于栖息环境上的部分一致性，如食性、聚集在光照的墙壁上等使该属种类存在一定性状上的趋同进化，造成多种壁虎在形态上差别较小。除非是专业的中药鉴定人员，否则很难从形态特征上区分各种壁虎。因此，作为一味名贵的中药材，市场上壁虎的混伪品层出不穷，管理者对正品壁虎和蜥虎鉴别能力不强，导致大量蜥虎充当壁虎售卖，牟取暴利。
[0003]目前壁虎尚未载入《中国药典》，对于壁虎的研究主要是形态学鉴别，在制剂的质量控制中很难发挥作用。建生药业对金龙胶囊中守宫使用指纹图谱进行化学表征，检测出尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶等内源性生物小分子类物质。然而动物药化学成分复杂，化合物分离分析难度大，无特有的化学成分，上述检测方法专属性不高，难以准确进行定性和定量检测。<br/>[0004]DNA分子技术不受样品形态、化学成分等的影响，可准确确定生物基原。其中，荧光定量PCR法(Quantitative Real
‑
time PCR，qPCR)和微滴式数字PCR法(Droplet Digital PCR，ddPCR)既可以用于定性检测，判断引物的特异性，也可以实现对目标片段的定量检测。申请人前期研究中发现目标片段的拷贝数与原始投料量呈一定的相关性，DNA拷贝数或许可以成为中成药质量控制的新指标。
[0005]因此，本专利技术结合这两种技术再通过对拷贝数的计算分析，对金龙胶囊中的守宫组分进行质量控制，建立一种准确有效的分子定量方法，为金龙胶囊质量控制提供新思路。

技术实现思路

[0006]针对上述技术问题，本专利技术提供一种准确度高、特异性好、灵敏度高、重复性好的质量控制方法，实现定性和定量检测金龙胶囊中的无蹼壁虎成分。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0008]本专利技术第一方面提供一种用于检测无蹼壁虎的引物和探针，所述引物包括引物1和引物2，其中，引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]本专利技术第二方面提供一种检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法，包括以下步骤：
[0010]提取目标检测物中的DNA；根据设计并合成的无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行qPCR检测；
[0011]或，提取目标检测物中的DNA；根据设计并合成的无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行ddPCR检测；
[0012]其中，所述TaqMan特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]进一步地，所述无蹼壁虎特异性引物包括引物1和引物2；其中，引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]进一步地，所述检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法，具体包括以下步骤：
[0015]提取目标检测物中的DNA；根据无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行qPCR检测；
[0016]或，提取目标检测物中的DNA；根据无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行ddPCR检测；
[0017]其中，所述TaqMan特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述无蹼壁虎特异性引物包括引物1和引物2；其中，引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018]在本专利技术的技术方案中，检测无蹼壁虎的qPCR鉴定方法的判定条件为：Ct值小于等于35时，结果为阳性，即目标检测物中包括无蹼壁虎，Ct值大于35时为阴性，即目标检测物中不包括无蹼壁虎。
[0019]在本专利技术的技术方案中，检测无蹼壁虎的ddPCR鉴定方法的判定条件为：根据检出的阳性微滴进行判断，出现大量阳性微滴时，目标检测物中包括无蹼壁虎，无大量阳性微滴时，目标检测物中不包括无蹼壁虎。
[0020]本专利技术第三方面提供上述用于检测无蹼壁虎的引物和探针或上述检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法在定性检测金龙胶囊的守宫成分中的应用。
[0021]本专利技术第四方面提供一种基于分子定量技术检测金龙胶囊守宫成分的质量控制方法，包括如下步骤：
[0022]根据守宫正品原动物无蹼壁虎与其混伪品线粒体基因组序列差异，设计合成物种特异性引物和特异性探针；提取金龙胶囊合格品的DNA，通过qPCR确定金龙胶囊合格品中无蹼壁虎特异片段的拷贝数范围；提取待检测金龙胶囊样品的DNA进行qPCR，计算无蹼壁虎特异片段的拷贝数；与合格品比对；
[0023]或，根据守宫正品原动物无蹼壁虎与其混伪品线粒体基因组序列差异，设计合成物种特异性引物和特异性探针；提取金龙胶囊合格品的DNA，通过ddPCR确定金龙胶囊合格品中无蹼壁虎特异片段的拷贝数范围；提取待检测金龙胶囊样品的DNA进行ddPCR，计算无蹼壁虎特异片段的拷贝数；与合格品比对；
[0024]其中，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示；
[0025]优选地，所述特异性探针的5
’
端修饰有荧光基团6
‑
FAM，3
’
端修饰有荧光猝灭基团BHQ1。
[0026]进一步地，所述基于分子定量技术检测金龙胶囊守宫成分的质量控制方法，具体包括如下步骤：
[0027]设计并合成无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；提取金龙胶囊合格品中的
DNA并通过qPCR确定金龙胶囊合格品中守宫特异片段的拷贝数范围；提取待测金龙胶囊中的DNA并进行qPCR检测，计算其守宫特异片段的拷贝数；比对；
[0028]其中，所述TaqMan特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示；
[0029]优选地，所述TaqMan特异性探针的5
’
端修饰有荧光基团6
‑
FAM，3
’
端修饰有荧光猝灭基团BHQ1。
[0030]或，具体包括如下步骤：设计并合成无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；提取金龙胶囊合格品中的DNA并通过ddPCR确定金龙胶囊合格品中守宫特异片段的拷贝数范围；提取待测金龙胶囊中的DNA并进行ddPCR检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测无蹼壁虎的引物和探针，其特征在于，所述引物包括引物1和引物2，其中，引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。2.检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取目标检测物中的DNA；根据设计并合成的无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行qPCR检测；或，提取目标检测物中的DNA；根据设计并合成的无蹼壁虎特异性引物和TaqMan特异性探针；进行ddPCR检测；其中，所述TaqMan特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求2所述的检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法，其特征在于，所述无蹼壁虎特异性引物包括引物1和引物2；其中，引物1的序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求2所述的检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法，其特征在于，所述qPCR检测的判定条件为：根据Ct值判断，Ct值小于等于35时，结果为目标检测物包括无蹼壁虎，Ct值大于35时目标检测物不包括无蹼壁虎；所述ddPCR的判定条件为：根据阳性微滴的检出判断目标检测物是否包括无蹼壁虎。5.根据权利要求1所述的用于检测无蹼壁虎的引物和探针或权利要求2
‑
4任一所述的检测无蹼壁虎的PCR鉴定方法在定性检测金龙胶囊中的守宫成分中的应用。6.基于分子定量技术检测金龙胶囊守宫成分的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：根据守宫正品原动物无蹼壁虎与其混伪品线粒体基因组序列差异，设计合成物种特异性引物和特异性探针；提取金龙胶囊合格品的DNA，通过qPCR确定金龙胶囊合格品中无蹼壁虎特异片段的拷贝数范围；提取待检测金龙胶囊样品的DNA进行qPCR，计算无蹼壁虎特异片段的拷贝数；与合格品比对；或，根据守宫正品原动物无蹼壁虎与其混伪品线粒体基因组序列差异，设计合成物种特异性引物和特异性探针；提取金龙胶囊合格品的DNA，通过ddPCR确定金龙胶囊合格品中无蹼壁虎特异片段的拷贝数范围；提取待检测金龙胶囊样品的DNA进行ddPCR，计算无蹼壁虎特异片段的拷贝数；与合格品比对；其中，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示；优选地，所述特异性探针的5
’
端修饰有荧光基团6
‑
FAM，3
’
端修饰有荧光猝灭基团BHQ1。7.根据权利要求6所述的基于分子定量技术检测金龙胶囊守宫成分的质量控制方法，其特征在于，所述qPCR确认的金龙胶囊合格品中的守宫特异片段的拷贝数范围为不小于2
×
102copies/mg，优选为2
×
102～5
×
102copies/mg，进一步优选为2.39
×
102～4.60
×
102copies/mg；所述ddPCR确认的金龙胶囊合格品中的守宫特异片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：晁志，梁永姗，李婵，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：