一种鉴定广地龙配方颗粒的特异性引物对及其应用组成比例

本发明专利技术公开了广地龙特异引物对、PCR试剂、PCR试剂盒和检测方法。该广地龙特异引物对由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。该PCR方法能准确检测中药配方颗粒中是否含有广地龙。鉴定方法准确、快捷，在鉴别广地龙与常见广地龙混伪品方面具有更高的特异性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定广地龙配方颗粒的特异性引物对及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种鉴定广地龙配方颗粒的特异性引物对及其应用。

技术介绍

[0002]地龙配方颗粒系指将地龙饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒。地龙是我国传统名贵中药，2015年版《中国药典》将其分为来源于参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的“广地龙”和来源于通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretimapectinifera Michaelsen的“沪地龙”两类。根据“国家药监局《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(2021年第16号)”的要求，来源如为多基原中药材，应固定一个基原，不同基原的中药材不可相互混用。故而，必须建立配方颗粒专属性鉴别方法。
[0003]地龙是中药商品基原物种最为复杂的中药之一，在我国主要药材市场至少有40种蚯蚓作为地龙入药。经课题起草单位2014～2018年对安徽亳州、河北安国、广州清平、广东普宁、山东舜王城、广西玉林、成都荷花池等主要药材市场进行市场调查发现，经随机采样抽取232批药材进行物种鉴定发现，我国地龙类药材共有34个物种基原，包括《中国药典》规定的参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓，及主要非药典品保宁腔蚓Metaphire magna(Chen,1938)，多肉远盲蚓Amynthascarnosus(Goto&Hatai,1899)，暗孔远盲蚓Amynthasobscuritoporus(Chen,1930)等，其中以保宁腔蚓居多，市售药材中少见威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓。在抽取的样品中，市售地龙商品总正品率为55％。
[0004]《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》还指出，中药配方颗粒各品种及其原料的性质可采用理化鉴别、色谱鉴别等方法，建立的方法应符合重现性、专属性和耐用性的验证要求。对于来源复杂的原料药材，必要时采用DNA分子鉴别技术进行物种真伪鉴别。由于地龙配方颗粒已失去所有形态特征，无法通过性状、显微鉴定，也难以找到专属性化学成分，故而增加DNA分子鉴定方法有助于进一步提高配方颗粒物种基原专属性控制水平。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了广地龙特异引物对，所述广地龙特异引物对由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。
[0006]可选地，所述广地龙特异引物对中的核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子和核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子的摩尔比为1:1。
[0007]所述广地龙特异引物对可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。
[0008]本专利技术还提供了一种鉴定广地龙的试剂，包括上述的广地龙特异引物对。
[0009]所述试剂可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙
混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。所述试剂可为PCR试剂。
[0010]本专利技术还提供了一种用于鉴定广地龙的试剂盒，包括上述的广地龙特异引物对或上述的试剂。
[0011]所述试剂盒可以用于鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓。所述试剂盒可为PCR试剂盒。
[0012]上述的广地龙特异引物对、上述的试剂或上述的试剂盒的应用也在本专利技术保护范围内。
[0013]该应用为如下A1)
‑
A8)任一种中的应用：
[0014]A1)在鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；
[0015]A2)在制备鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品的产品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；
[0016]A3)在鉴定或辅助鉴定广地龙中的应用；
[0017]A4)在制备鉴定或辅助鉴定广地龙的产品中的应用；
[0018]A5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙中的应用；
[0019]A6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙的产品中的应用；。
[0020]A7)在制备鉴别广地龙配方颗粒真伪的产品中的应用；
[0021]A8)在鉴别广地龙配方颗粒真伪中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否为广地龙或是否含有广地龙的方法，所述方法包括如下步骤：
[0023]a1)采用上述广地龙特异引物对对所述待测样本的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0024]a2)凝胶电泳检测所述扩增产物，根据检测结果按照如下确定所述待测样本是否为广地龙或是否含有广地龙：若所述扩增产物在100～250bp之间(如170bp)有单一DNA条带者，则所述待测样本为或候选为广地龙，或者含有或候选含有广地龙；若所述扩增产物在100～250bp之间(如170bp)没有DNA条带者，则所述待测样本不为或候选不为广地龙，或者不含有或候选不含有广地龙。
[0025]具体地，上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为62℃退火2min。
[0026]具体地，上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应程序为：94℃初始变性5min；94℃变性30s，62℃退火2min，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸60min。
[0027]具体地，上述方法中，所述方法中PCR反应体系中模板DNA浓度为30ng/25μl，Taq DNA聚合酶为2
×
M5PCR Mix。
[0028]本专利技术建立了可同时区分广地龙及常见广地龙混伪品通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓或暗孔远盲蚓的PCR检测体系。
[0029]本专利技术的引物对、PCR试剂、PCR试剂盒准确、快捷，在鉴别广地龙与常见广地龙混伪品(通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓或暗孔远盲蚓)方面，尤其是中药配方颗粒中是否含有广地龙，具有更高的准确性与适应性，具有重要的应用价值。
附图说明
[0030]图1为本专利技术实施例1中退火温度对广地龙(参环毛蚓)配方颗粒鉴别结果的影响。图中，泳道M：DL5000 Marker；1:：广地龙药材(19本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.广地龙特异引物对，其特征在于：所述广地龙特异引物对由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。2.根据权利要求1所述的广地龙特异引物对，其特征在于：所述广地龙特异引物对中的两条引物之间的摩尔比为1:1。3.用于鉴定广地龙的试剂，其特征在于：包括权利要求1或2所述的广地龙特异引物对。4.用于鉴定广地龙的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的广地龙特异引物对或权利要求3所述的试剂。5.权利要求1或2所述的广地龙特异引物对、权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在如下A1)
‑
A8)任一种中的应用；A1)在鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；A2)在制备鉴别或辅助鉴别广地龙及常见广地龙混伪品的产品中的应用，所述常见广地龙混伪品为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、多肉远盲蚓、壮伟远盲蚓、保宁腔蚓、皮质远盲蚓和/或暗孔远盲蚓；A3)在鉴定或辅助鉴定广地龙中的应用；A4)在制备鉴定或辅助鉴定广地龙的产品中的应用；A5)在鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙中的应用；A6)在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有广地龙的产品中的应用；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，袁媛，谭沛，蒋超，郑晓英，江斌，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：