减毒登革病毒制造技术

本发明专利技术提供了修饰的黄病毒，例如修饰的1型、2型、3型、4型登革病毒，这些病毒的组合，或这些病毒的四价组合。与亲本病毒相比，根据本发明专利技术各个方面的修饰导致病毒蛋白表达降低，其中，表达降低是重新编码病毒的一个或多个区域的结果。例如，可对prM或包膜(E)区进行重新编码。在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来对一个或多个区域进行重新编码。这些修饰的黄病毒用作疫苗组合物以提供保护性免疫应答。用作疫苗组合物以提供保护性免疫应答。用作疫苗组合物以提供保护性免疫应答。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】减毒登革病毒
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请包括2019年6月25日递交的美国临时专利申请No.62/866,477在35 U.S.C.
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119(e)下的优先权的权益，在此以引用的方式将其整体并入。


[0003]本专利技术提供高度减毒的黄病毒(flaviviruses)、特别是减毒登革病毒(dengue viruses)，以及疫苗。减毒病毒提供保护性免疫力使得免受相同谱系病毒的攻击，以及针对异源病毒的交叉保护。

技术介绍

[0004]登革病毒(DENV)是属于黄病毒科(Flaviviridae)的单链正链RNA病毒，在同一属(黄病毒，Flavivirus)中包括寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)。根据世界卫生组织(WHO)，目前约有25亿人(占世界人口的近一半)处于来自DENV的风险中，并且估计全球每年可能有5000万例DENV感染病例。DENV在系统发育上与ZIKV密切相关，并与ZIKV和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，一种甲病毒)二者共享常见的蚊子介体埃及伊蚊(Aedes aegypti)。特别要担心的是旅游者处于DENV感染的风险中，另外还要担心这种流行病输入和传播到诸如美国南部的地方。在整个美国南部都发现了DENV的介体埃及伊蚊。白纹伊蚊(Aedes albopictus，亚洲虎斑蚊)也具有传递DENV的能力。如果DENV在美国进入白纹伊蚊(A.albopictus)种群，其将大大扩展到美国中西部和东北部的延伸范围。
[0005]抗体依赖性增强(ADE)现象使黄病毒疫苗的开发更加复杂。先前一种黄病毒的感染使个体在再次感染不同血清型后易出现疾病严重程度增加时，发生ADE。在ADE期间，针对第一种病毒的抗体结合第二种病毒但不中和第二种病毒，反而增加其感染性。DENV在许多国家中很普遍，因此任何疫苗策略都必须考虑对已建立登革热免疫力的人群的影响。值得注意的是，具有潜在DENV免疫力的人可能经历来自DENV活疫苗的不良事件增加，因为其DENV免疫力可能增强DENV疫苗株的感染性，从而导致不良事件增加。这些情况都是在开发DENV疫苗(无论是活的、灭活的还是基于抗原/VLP/骨架载体的)时需要考虑的可能情况。由于由ADE引起的黄病毒感染增强的可能性很高，因此所有疫苗开发策略都需要考虑任何给定的DENV疫苗可能如何与现有的针对黄病毒的抗体或后续的黄病毒感染相互作用。
[0006]登革病毒包括黄病毒科中蚊子携带的黄病毒的四种血清型(DENV1
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4)。登革病毒是具有二十面体病毒粒子的包膜病毒，其包含C(核心)、M(膜)和E(包膜)糖蛋白，直径为40
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65纳米。登革病毒基因组为长度在10,000
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11,000个碱基的单链正链RNA分子，编码结构蛋白(C、prM、E)和非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS4和NS5)。登革病毒在细胞胞质中转录并复制其基因组，并将基因组翻译成单个多肽，所述多肽被宿主和病毒蛋白切割并加工。登革病毒是在热带地区引起国际关注的新兴事物，并且各个血清型在遗传上和抗原上都是不同的病毒。
[0007]因此，在本领域中仍然需要开发预防或降低感染的疫苗。

技术实现思路

[0008]本文描述了通过大量同义核苷酸突变修饰E区而产生的重新编码的登革病毒在提供针对致死性野生型攻击的保护性免疫和针对不同谱系的交叉保护中高度有效。此外，所述病毒具有出色的安全性。
[0009]因此，本专利技术的各种实施方式提供了减毒的登革病毒，其中通过E编码区的密码子对去优化而降低病毒蛋白的表达。在某些实施方式中，E是所靶向的唯一的病毒蛋白编码区。在某些实施方式中，当对除E以外的另一登革病毒蛋白编码区去优化时，所述降低小于E的降低。根据本专利技术，本专利技术的病毒蛋白表达的降低通过以下实现：改变蛋白编码序列，例如通过减低蛋白编码序列的密码子对偏好性，置换稀有密码子，修饰G+C含量，修饰CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量，或者其组合。也可通过修饰蛋白的调节序列来实现表达的降低。
[0010]在某些实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在其它实施方式中，降低密码子对偏好性包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在某些实施方式中，E蛋白编码序列具有小于
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0.1、或小于
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0.2、或小于
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0.3、或小于
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0.4的密码子对偏好性。如Coleman等，2000和本文中所述，来计算蛋白编码序列(即，开放阅读框)的密码子对偏好性。
[0011]在本专利技术的实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为宿主中较不频繁的同义密码子，使E蛋白编码序列的表达降低。
[0012]在本专利技术的实施方式中，E蛋白编码序列DENV血清型存在于来自相同DENV血清型的不同毒株或同源毒株的背景中。
[0013]本专利技术还提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含其中病毒翻译降低但与wt病毒保持至少90％的抗原同一性的病毒。在一些实施方式中，病毒翻译降低，但与wt病毒保持至少95％、96％、97％、98％或99％的抗原同一性。在一些实施方式中，病毒翻译降低，但与wt病毒保持100％抗原同一性。
[0014]本专利技术还提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含减毒登革病毒的疫苗组合物，其中，病毒蛋白的表达降低至少10％。在各种实施方式中，病毒蛋白的表达降低至少15％、至少20％或至少25％。在本专利技术的实施方式中，引发对与疫苗的减毒病毒相同谱系的登革病毒有效的免疫应答。在另一实施方式中，引发对异源登革病毒有效的免疫应答。
[0015]本专利技术还提供了制备减毒登革病毒基因组的方法，所述方法包括：a)获得基因组核苷酸；b)对包膜编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，并对非结构蛋白3编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，以及将重新编码的核苷酸序列置换进登革病毒基因组，以制备减毒登革病毒基因组。在某些实施方式中，仅靶向E区。在一些实施方式中，另一病毒蛋白编码区的表达也降低。
[0016]本专利技术还提供了使用重叠PCR(overlapping PCR)通过T7聚合酶构建模板登革病毒DNA序列的方法，所述模板登革病毒DNA序列用于转录感染性病毒RNA基因组。将具有同源骨架的所有登革基因组从5'末端开始分为三个片段(片段1：nt1
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3596；片段2：nt3030
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6959；和片段3：nt：nt6851
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末端)，并进行化学/生物化学合成。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含：重新编码的prM蛋白，重新编码的包膜(E)蛋白，或两者，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，以及其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。2.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，与其亲本登革病毒相比，所述prM蛋白或E蛋白或两者的表达降低。3.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。4.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。5.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。6.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。7.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。8.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。9.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于
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0.05的密码子对偏好性。10.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自的密码子对偏好性降低至少0.05。11.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。12.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒。13.一种用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，所述登革疫苗组合物包含如权利要求1
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12中任一项所述的修饰的登革病毒以及药学上可接受的赋形剂或载体。14.一种在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予有效剂量组合物，所述组合物包含如权利要求1
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12中任一项所述的修饰的登革病毒。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述免疫应答为保护性免疫应答，并且给予预防有效剂量或治疗有效剂量的权利要求所述的疫苗组合物。16.如权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者给予至少一种佐剂。17.如权利要求14所述的方法，其中，所述免疫应答针对异源登革病毒是交叉保护性
的。18.一种在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特芬，
申请(专利权)人：科达金尼克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：