一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术，公开了一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。该筛选方法包括以下步骤：(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；(3)将实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。本发明专利技术通过分析各候选内参基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT

【技术实现步骤摘要】
一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程技术，具体地，涉及一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。

技术介绍

[0002]乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)常绿灌木，与蓝莓同属，其小浆果是饮食中酚类物质如黄酮醇和花青素的丰富来源。乌饭树也是一种药用植物，其果实和叶提取物具有镇定催眠、预防癌症等积极作用。
[0003]乌饭树的果、叶、根均可入药食用，记载于《开宝本草》、《本草纲目》、《中药大辞典》等中医药典籍，被我国历代本草学家极为推崇。在《中药大辞典》中，乌饭树被记载为具有“益精气、强筋骨、明目止泻”的功效；在唐代《本草拾遗》中就有记载“乌饭树树叶取汁渍米作乌饭，食之健如牛筋；止泻除睡，强筋益气力”。乌饭树中的黑色素含有极为丰富的有效成分，如花青素类、黄酮类、多酚类化合物、绿原酸类、环烯醚萜苷类、单宁类、三菇类、有机酸类、肌醇类和维生素等。随着对乌饭树资源的研究不断深入，其叶和果实中功能性成分的分子验证尤为重要。
[0004]实时荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)是分子验证的重要手段，而qRT
‑
PCR验证最重要的一个环节是内参基因的选择。传统的越橘属所使用的内参基因如actin、β
‑
tubulin等，在乌饭树果实膨大成熟过程中，一般呈上调表达模式，不适合分析果实发育基因的转录水平。现有技术中，关于乌饭树内参基因的鉴定工作还未有相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
[0007](1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；
[0008](2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；
[0009](3)将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。
[0010]优选地，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.10所示。
[0011]优选地，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11
‑
SEQ ID NO.30所示。
[0012]优选地，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用Primer Premier软件提供多个与所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将所述备选引物对进行评分和特异性评价，筛选出该乌饭树候选内参基因对应的所述内参基因引物对。
[0013]优选地，所述评分的条件包括：
[0014]a、引物的长度在20
‑
24bp之间；
[0015]b、引物3
’
端的5个碱基中含有1
‑
3个G、C，末尾不是A；
[0016]c、扩增长度在80
‑
150bp之间；
[0017]d、引物序列的GC含量在50％
‑
60％范围内；
[0018]e、引物序列自身二聚体和交叉二聚体连续的碱基数少于4个，不连续的少于7个；
[0019]f、没有发卡结构的二聚体。
[0020]优选地，所述特异性评价通过所述实时荧光定量PCR的溶解曲线进行评价。
[0021]优选地，步骤(2)中，以1μg所述乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为基准，所述内参基因引物对中的每条引物的用量为0.1
×
10
‑3‑1×
10
‑3μmol。
[0022]优选地，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：90
‑
100℃预变10
‑
20min；90
‑
100℃解链5
‑
15s，55
‑
65℃退火25
‑
35s，反应35
‑
45个循环。
[0023]优选地，步骤(2)中，所述乌饭树组织选自乌饭树果实、乌饭树叶片和乌饭树嫩根中的至少一种。
[0024]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术通过分析各乌饭树候选内参基因的表达变化，筛选出稳定性较高的基因作为乌饭树实时荧光定量PCR的内参基因，为研究乌饭树基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT
‑
PCR数据。
附图说明
[0026]图1是实施例中10个乌饭树候选内参基因的溶解曲线图，其中，a为actin1，b为actin2，c为actin3，d为actin4，e为actin5，f为RP，g为UBE，h为UBQ，i为NADH，j为ADK；
[0027]图2是实施例中10个乌饭树候选内参基因的Ct值分布图；
[0028]图3是实施例中GeNorm软件分析乌饭树候选内参基因的表达稳定性；
[0029]图4是实施例中GeNorm软件分析乌饭树内参基因的最适数目；
[0030]图5是实施例中以NADH、ADK、NADH+ADK作为内参基因，分析乌饭树3个不同成熟度果实(绿果S1、红果S2和蓝果S3)中ACO与PG的表达量。
具体实施方式
[0031]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
ID NO.16所示：
[0050]正向引物actin3
‑
F：CTCCAAGGACAGATTCAAGAGG(SEQ ID NO.15)；
[0051]反向引物actin3
‑
R：GAGCAGCACGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；(3)将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.10所示。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11
‑
SEQ ID NO.30所示。4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用Primer Premier软件提供多个与所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将所述备选引物对进行评分和特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖家欣，何锋，桂良仙，张晓平，樊基胜，张春龙，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：