凤丹耐涝差异表达基因及基于转录组测序挖掘的方法技术

本发明专利技术公开了凤丹耐涝差异表达基因及基于转录组测序挖掘的方法，属于油用牡丹耐涝基因技术领域。包括以下内容：（1）在涝害胁迫处理和正常条件下分别培养凤丹盆栽苗，获得实验组和对照组组织样本；（2）对上述组织样本分别提取RNA，进而进行转录组测序；（3）对测序获得的数据进行整理分析，获得差异表达基因，筛选出参与凤丹涝害胁迫的数个unigenes，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类。本发明专利技术以凤丹内在的遗传基因作为起点，基于转录组对牡丹耐涝的基因进行分析，筛选出耐涝害胁迫的基因，以期用来培育耐涝的凤丹新品种或者新种质，达到提高

【技术实现步骤摘要】
凤丹耐涝差异表达基因及基于转录组测序挖掘的方法


[0001]本专利技术涉及凤丹耐涝差异表达基因及基于转录组测序挖掘的方法，属于耐涝油用牡丹基因挖掘


技术介绍

[0002]油用牡丹是一种新型的木本油料作物，具有抗干旱、耐瘠薄、抗严寒、耐庇荫等特点。其籽粒提取的牡丹籽油含有高达92%的不饱和脂肪酸，其中对人体健康非常有利的α
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亚麻酸高达43%。
‘
凤丹
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是适合江南地区种植的油用牡丹品种，其根系属于肉质根，对水分较为敏感，是一类不耐涝的植物，每年因雨水在很大程度上影响了
‘
凤丹
’
的产量和品质。如何提高其耐涝性，培育出耐涝新品种已成为生产中迫切需要解决的问题。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供凤丹耐涝差异表达基因及基于转录组测序挖掘的方法。
[0004]为达到上述目的，本专利技术采用的实施方案如下：一种基于转录组测序挖掘凤丹耐涝差异表达基因的方法，步骤一、在涝害和正常环境下分别培养油用牡丹凤丹盆栽苗，获得涝害实验组和正常对照组幼嫩叶片组织样本；步骤二、对上述获得的组织样本，分别提取总RNA，进而构建相应的cDNA文库，并开展进一步的转录组测序；步骤三、基于NR数据库、Swissprot数据库、KOG数据库和KEGG数据库对unigenes进行注释；步骤四、采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值< 0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路，以FDR< 0.01、Log2FC≥1为筛选条件，筛选获得上调或下调的差异表达基因；步骤五、对上述获得的差异表达基因，采用KEGG和GO功能分析软件进行注释，进一步明确基因所参与的功能和代谢通路；步骤六、设置筛选条件，以Log2FC≥2、差异表达基因长度大于450 bp、覆盖度大于80%、同源度大于95%作为筛选条件，通过BlastX比对，筛选出参与凤丹涝害胁迫的unigenes，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类，并依据RPKM值筛选出凤丹耐涝的基因。
[0005]步骤二中，从组装转录本中共获得74756个参考单基因，平均长度为743 bp，长度范围为201
‑
12252 bp。
[0006]步骤三中，共有33278个unigenes，占44.51%，与四个数据库中的一个或多个数据库匹配，在所有四个数据库中共有9761个unigenes，占13.06%。
[0007]步骤四中，以FDR< 0.01、Log2FC≥1为筛选条件，筛选获得上调或下调的差异表达
基因，包括155个上调基因和625个下调基因。
[0008]步骤六中，筛选出25个RPKM值大于200的差异表达基因，作为凤丹耐涝差异表达的候选基因。
[0009]凤丹耐涝差异表达基因，包括25个RPKM值大于200的差异表达基因。
[0010]本专利技术的有益效果是：以油用牡丹
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凤丹
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内在的遗传基因作为起点，基于转录组对耐涝
‘
凤丹
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的基因进行分析，筛选出耐涝害胁迫的基因型，以期用来培育耐涝的
‘
凤丹
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新品种或新种质，达到提高
‘
凤丹
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籽油产量和品质的目的。
附图说明
[0011]图1为四大数据库注释维恩图。
[0012]图2为PCA热图。
[0013]图3为上调和下调表达的差异基因数目。
[0014]图4A为差异富集分析GO分类图（下调）。
[0015]图4B为差异富集分析GO分类图（上调）。
[0016]图5为差异富集分析KEGG富集图。
[0017]图6 A为qRT
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PCR验证结果。
[0018]图6 B为qRT
‑
PCR验证结果的数据相关性。
具体实施方式
[0019]以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步的阐述。
[0020]实施例1 凤丹涝害胁迫处理以江南油用牡丹
‘
凤丹
’
3年生盆栽苗（1加仑盆）为材料，实验组放置在长、宽、高分别为35 cm、30 cm、45 cm的泡沫盒内，灌水直至淹没盆土以上至少2 cm的深度，在露天无雨水的情况下进行培养；以正常环境下培养的3年生
‘
凤丹
’
盆栽苗作为对照组。培养48 h后，分别采集实验组和对照组的幼嫩叶片作为组织样本，液氮速冻后
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80 ℃低温冰箱保存备用。
[0021]实施例2 转录组测序对上述获得的
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凤丹
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组织样本各3个重复，采用植物总RNA提取试剂盒（GeneMark公司）分别提取叶片总RNA，进而构建相应的cDNA文库（Li等, 2017），从而获得3个实验组（W
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1、W
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2、W
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3）和3个对照组（Ck
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1、Ck
‑
2、Ck
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3）的cDNA文库，构建的文库采用IIIumina HiSeq 2500平台（美国IIIumina）进行转录组测序。
[0022]实施例3 测序数据整理和分析对上述测序获得的转录组数据进行组装和基因注释。基于以下数据库对基因功能进行注释：NR数据库、Swissprot数据库、KOG数据库和KEGG数据库。
[0023]总共生成了444382372个Illumina原始reads，长度介于50
‑
151 bp。在移除适配器序列和低质量读数后，得到438315223个高质量的reads，用于后续分析。所有reads被分为三类，包括未匹配、单一匹配和多重匹配reads。其中，79
‑
84%属于单一匹配，而只有7
‑
9%属于多重匹配。同时，每个样本中的表达基因数量从57024到61583个不等。从组装转录本中共获得74756个参考单基因，平均长度为743 bp，长度范围为201
‑
12252 bp。
[0024]采用四个公共数据库对unigenes进行注释，见图1。注释结果显示，NR数据库中匹配了33105个unigenes（44.28%），Swissprot数据库中匹配了22715个（30.38%），KOG数据库中匹配了19613个（26.24%），KEGG数据库中匹配了12763个（17.07%）。共有33278个unigenes（44.51%）与四个数据库中的一个或多个数据库匹配，在所有四个数据库中共有9761个unigenes（13.06%）。
[0025]实施例4 涝害处理下
‘
凤丹<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于转录组测序挖掘凤丹耐涝差异表达基因的方法，其特征在于，步骤一、在涝害和正常环境下分别培养油用牡丹凤丹盆栽苗，获得涝害实验组和正常对照组幼嫩叶片组织样本；步骤二、对上述获得的组织样本，分别提取总RNA，进而构建相应的cDNA文库，并开展进一步的转录组测序；步骤三、基于NR数据库、Swissprot数据库、KOG数据库和KEGG数据库对unigenes进行注释；步骤四、采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值&lt; 0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路，以FDR&lt; 0.01、Log2FC≥1为筛选条件，筛选获得上调或下调的差异表达基因；步骤五、对上述获得的差异表达基因，采用KEGG和GO功能分析软件进行注释，进一步明确基因所参与的功能和代谢通路；步骤六、设置筛选条件，以Log2FC≥2、差异表达基因长度大于450 bp、覆盖度大于80%、同源度大于95%作为筛选条件，通过BlastX比对，筛选出参与凤丹涝害胁迫的unigenes，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类，并依据RPKM值筛选出凤丹耐涝的基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中，从组装转录本中共获得74756个参考单基因，平均长度为743 bp，长度范围为201
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12252 bp。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，共有33278个unigenes，占44.51%，与四个数据库中的一个或多个数据库匹配，在所有四个数据库中共有9761个unigenes，占13.06%。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四中，以FDR&lt; 0.01、Log2FC≥1为筛选条件，筛选获得上调或下调的差异表达基因，包括155个上调基因和625个下调基因。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧春，朱开元，张加强，许雯婷，周江华，
申请(专利权)人：浙江省园林植物与花卉研究所浙江省萧山棉麻研究所，
类型：发明
国别省市：