一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术采用转录组测序、小RNA测序、降解组测序的手段，筛选得到与植物发育分子机制相关的差异表达miRNAs

【技术实现步骤摘要】
一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法及其应用。

技术介绍

[0002]miRNA是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA，是真核生物中几乎所有生物过程的关键调控因子。在植物体内，miRNA能够通过与靶mRNA分子的互补序列结合，使其降解或抑制其翻译，在转录后水平调控靶基因的表达，一直是遗传、发育、干细胞等多个研究领域中的研究热点。miRNA能够联合上游调控基因和下游靶基因，在植物的胚胎发育、分生组织和器官发生等关键发育过程中发挥重要作用。
[0003]现有研究成果显示，几乎所有miRNAs均受到多个转录因子的调控，同时miRNAs也作用于包括转录因子基因的众多靶基因。转录因子通过特异结合下游基因启动子区的DNA顺式作用元件，对基因(包括miRNA)的转录起到激活或者抑制等作用，形成“miRNA
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转录因子
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靶基因(miRNA)”组成的较为复杂的转录调控网络，参与包括植物生长和发育的多个生物通路。因此，miRNA可以通过与上游调控基因和下游靶基因构成复杂调控网络，参与植物的物质和能量代谢、激素信号转导和逆境胁迫响应等多生物过程，在转录水平调控植物的生长发育。
[0004]但是，现有技术中往往通过组学手段仅实现批量发掘候选miRNA和靶基因，后根据miRNA与靶基因之间的互作特点通过软件预测miRNA
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靶基因对，因此得到的调控网络中的节点miRNA和靶基因的假阳性概率很大，导致据此发掘的调控因子或基因不能真正反映植物发育过程，对指导育种的价值不大。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法，可以精确实现节点基因和miRNA在特定发育时期和发育组织中的定位。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]采用测序手段筛选植物组织的差异表达miRNAs
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靶基因对；利用双荧光素酶报告检测技术验证差异表达miRNAs
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靶基因对的作用关系；利用荧光原位杂交技术定位差异表达miRNAs
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靶基因对在植物组织细胞中的作用位置，即可获得调控植物发育的关键调控因子。
[0009]优选的，所述测序手段包括转录组测序、小RNA测序和降解组测序。
[0010]优选的，通过转录组测序筛选相邻发育期组织细胞中的差异表达基因。
[0011]优选的，通过小RNA测序筛选相邻发育期组织细胞中的差异表达miRNA。
[0012]优选的，根据所得差异表达基因和差异表达miRNA，预测所述差异表达miRNA的靶
基因。
[0013]优选的，对预测得到的差异表达miRNA及其靶基因进行关联分析，得到表达模式具有负相关关系的差异表达miRNAs
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靶基因对。
[0014]优选的，通过降解组测序预测差异表达miRNAs
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靶基因对的互作关系和作用位点。
[0015]优选的，利用双荧光素酶检测上述预测得到的差异表达miRNAs
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靶基因对，得到检测结果为阳性的miRNAs
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靶基因对。
[0016]优选的，将检测结果为阳性的miRNAs
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靶基因对进行荧光原位杂交，确定miRNA及其靶基因是否能够定位在样本的同一组织。
[0017]本专利技术还提供了上述方法在构建分子调控网络或分子育种中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术技术方案的有益效果如下：
[0019]本专利技术联合利用多组学高通量测序手段和分子生物学技术方法，批量发掘调控植物某一或/和某些组织和细胞发育的miRNA及其靶基因，并首次运用双荧光素酶报告检测技术和荧光原位杂交技术定位发掘到的候选miRNA及其靶基因在组织和细胞中的位置，精确地实现节点基因和miRNA在发育组织中的定位。
[0020]本专利技术通过所述发掘调控植物发育关键调控因子的方法，可以建立起植物某一或/和某些组织和细胞发育的miRNA及其靶基因的调控网络，并进一步用于指导分子育种。
附图说明
[0021]图1为发掘调控植物发育关键调控因子流程图；
[0022]图2为植物信息学分析实验流程图；
[0023]图3为小RNA测序和分析实验流程；
[0024]图4为RNA末端平行分析实验流程；
[0025]图5为降解组测序信息分析流程图；
[0026]图6为荧光原位杂交Fish实验定位ped
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miR160a
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5p能够在发育早期笋芽的原形成层(箭头1)发挥作用；标尺＝100μm。
[0027]图7为荧光原位杂交Fish实验定位ped
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miR166a
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3p能够在笋芽发育早期的顶端分生组织(箭头1)发挥作用；标尺＝100μm。
[0028]图8为荧光原位杂交Fish实验定位ped
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miR166a
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3p能够在毛竹(A)和厚竹(B)发育中期笋芽的维管组织(箭头)发挥作用；标尺＝100μm。
具体实施方式
[0029]本专利技术提供了一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0030]采用测序手段筛选植物组织的差异表达miRNAs
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靶基因对；利用双荧光素酶报告检测技术验证差异表达miRNAs
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靶基因对的作用关系；利用荧光原位杂交技术定位差异表达miRNAs
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靶基因对在植物组织细胞中的作用位置，即可获得调控植物发育的关键调控因子。
[0031]本专利技术通过选择同一植物相邻发育时期组织的RNA为样本，通过比对相邻两个发育时期的细胞或组织中RNA的差异，借助测序手段筛选得到后一发育期与其相邻的前一发
育期之间的差异表达miRNAs
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靶基因对，以得到后一发育期相较于其相邻的前一发育期的miRNAs和表达基因的变化，从而得到调控该组织中后一发育期的关键调控因子。本专利技术对具体的植物品种不作限定，可以包括多种植物的各种发育时期。
[0032]本专利技术还可以通过选择不同植物同一组织的RNA为样本，通过比对两植物该组织中RNA的差异，借助测序手段筛选得到影响植物组织不同发育特征的差异表达miRNAs
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靶基因对，以得到不同植物中调控该组织发育的关键调控因子。本专利技术对具体的植物品种不作限定。本专利技术所述不同植物品种为同种属或同源性的两植物品种，包括但不限于人工种植型植物和其同种属野生型植物。
[0033]在本专利技术中，所述测序手段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发掘调控植物发育关键调控因子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用测序手段筛选植物组织的差异表达miRNAs
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靶基因对；利用双荧光素酶报告检测技术验证差异表达miRNAs
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靶基因对的作用关系；利用荧光原位杂交技术定位差异表达miRNAs
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靶基因对在植物组织细胞中的作用位置，即可获得调控植物发育的关键调控因子。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序手段包括转录组测序、小RNA测序和降解组测序。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过转录组测序筛选相邻发育期组织细胞中的差异表达基因。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过小RNA测序筛选相邻发育期组织细胞中的差异表达miRNA。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，根据所得差异表达基因和差异表达miRNA，预测所述差异表达miRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英，高志民，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：