本发明专利技术公开了一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，属于分子生物学领域；包括下述步骤：(1)提取泡桐总RNA；(2)m6A测序：利用泡桐总RNA构建m6A文库，进行测序；(3)转录组测序：利用泡桐总RNA构建转录组文库，进行测序；(4)生物信息学分析：对m6A测序结果进行Peak分析，绘制出白花泡桐m6A修饰图谱，并基于Peak分析结果进行m6Amotif预测；对转录组测序结果进行转录组分析；进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因。通过本发明专利技术方法进行泡桐丛枝病相关基因的分析筛选，为进一步探究泡桐丛枝病的发病机理提供研究思路并打下基础，有助于泡桐丛枝病的防治研究。有助于泡桐丛枝病的防治研究。有助于泡桐丛枝病的防治研究。
【技术实现步骤摘要】
一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法
[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法。
技术介绍
[0002]泡桐，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂；假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强；其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。
[0003]在生产中，由植原体引起的泡桐丛枝病是制约泡桐产业发展的重要因素，由于泡桐丛枝植原体不能体外培养，严重限制了泡桐丛枝病发病机理的阐明。泡桐丛枝病的发生、发展是一个非常复杂的过程，目前泡桐丛枝病发病机理仍未阐明，丛枝病的防治的有效方法仍未建立，因此，还需要开辟新的途径进行研究。
[0004]因此，如何提供一种泡桐丛枝病的研究方法，为泡桐丛枝病的防治提供依据是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术公开了一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，从m6A修饰调控泡桐丛枝病的角度入手，结合转录组分析结果进行泡桐丛枝病相关基因的分析筛选，为进一步探究泡桐丛枝病的发病机理提供研究思路并打下基础，有助于泡桐丛枝病的防治研究。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，包括下述步骤：
[0008](1)提取泡桐总RNA
[0009]分别提取泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测；
[0010](2)m6A测序
[0011]利用泡桐总RNA构建m6A文库，进行测序；
[0012](3)转录组测序
[0013]利用泡桐总RNA构建转录组文库，进行测序；
[0014](4)生物信息学分析
[0015]对m6A测序结果进行Peak分析，绘制出白花泡桐m6A修饰图谱，并基于Peak分析结果进行m6Amotif预测；
[0016]对转录组测序结果进行转录组分析；
[0017]进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因。
[0018]优选地，步骤(2)中，
[0019]通过m6A特异性抗体对具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段构建文库，进行高通量测序。
[0020]优选地，步骤(3)所用泡桐总RNA和步骤(2)所用泡桐总RNA为同时获得的，一份用于m6A测序，另一份用于转录组测序。
[0021]优选地，步骤(4)中，
[0022]富集最显著的Motif序列为UUGUUUUGUACU，SEQ ID NO.1。
[0023]优选地，步骤(4)中，
[0024]转录组分析包括基本信息分析、基因的表达水平分析、差异表达分析、GO富集分析和KEGG富集分析。
[0025]优选地，步骤(4)中，进行m6A与转录组的关联分析时：
[0026]根据m6A
‑
seq差异筛选标准“p<0.05”将差异甲基化基因分为上调和下调；
[0027]根据RNA
‑
seq差异筛选标准“|log2 fold change|≥1，p<0.05”将转录组分析获得的差异基因分为上调和下调；
[0028]比较m6A甲基化水平与基因表达之间的关系：
[0029]①
m6A修饰水平和转录水平都上调的基因；
[0030]②
m6A修饰水平上调而转录水平下调的基因；
[0031]③
m6A修饰水平下调而转录水平上调的基因；
[0032]④
m6A修饰水平和转录水平都下调的基因；
[0033]从中筛选出泡桐丛枝病相关基因。
[0034]综上所述，本专利技术通过m6A免疫共沉淀结合高通量测序技术，绘制了白花泡桐m6A修饰图谱，揭示了丛枝植原体侵染后发生m6A修饰基序为UUGUUUUGUACU，筛选出泡桐丛枝病相关基因，为泡桐丛枝病的防治提供有力依据。
附图说明
[0035]图1所示为样品对比图片；其中，
[0036]A.不使用MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗，具有明显的丛枝症状；
[0037]B.使用60mg
·
L
‑1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗，丛枝症状恢复为健康状态。
[0038]图2所示为白花泡桐m6A修饰图谱；
[0039]A.白花泡桐丛枝病苗；
[0040]B.60mg
·
L
‑1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗。
具体实施方式
[0041]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0042]实施例1
[0043]一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，包括下述步骤：
[0044]1.提取泡桐总RNA
[0045]取白花泡桐丛枝病苗，分别设置使用60mg
·
L
‑1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组和未使用60mg
·
L
‑1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组，培养30d；如图1所示，未使用60mg
·
L
‑1甲基磺酸甲
酯处理组白花泡桐丛枝病苗具有明显的丛枝症状，使用60mg
·
L
‑1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗丛枝症状恢复为健康状态。
[0046]取每组长势均匀的泡桐顶芽作为样本，每组设置平行试验，液氮速冻保存于
‑
80℃冰箱，为后续试验做准备。
[0047]分别提取上述保存的泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测，样品总RNA经检测合格，用于后续试验。
[0048]2.m6A测序
[0049]将检测合格的样品总RNA分成2份，其中一份与m6A特异性抗体在IP缓冲液(50mM Tris
‑
HCl，750mM NaCl和0.5％Igepal CA
‑
630)中4℃孵育2h，孵育产物再与A蛋白珠孵育，并用洗脱缓冲液(1
×
IP buffer and 6.7mM m6A)进行洗脱，再用75％乙醇沉淀洗脱的RNA。最后，对洗脱的含m6A片段(IP)进行回收，将富集到的RNA构建文库，在IlluminaNovaseq6000平台上进行双端2
×
150bp测序。
[0050]3.转录组测序
[0051]另一份样品总RNA用于转录组测序，采用Illumina公司Ribo
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)提取泡桐总RNA分别提取泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测；(2)m6A测序利用泡桐总RNA构建m6A文库，进行测序；(3)转录组测序利用泡桐总RNA构建转录组文库，进行测序；(4)生物信息学分析对m6A测序结果进行Peak分析，绘制出白花泡桐m6A修饰图谱，并基于Peak分析结果进行m6Amotif预测；对转录组测序结果进行转录组分析；进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因。2.根据权利要求1所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过m6A特异性抗体对具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段构建文库，进行高通量测序。3.根据权利要求2所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤(3)所用泡桐总RNA和步骤(2)所用泡桐总RNA为同时获得的，一份用于m6A测序，另一份用于转录组测序。4.根据权利要求1所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤(4)中，富集最显著的Motif序...
【专利技术属性】
技术研发人员：范国强，翟晓巧，王哲，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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