芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因、核酸分子及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物基因及其研究应用技术领域，公开了一种芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因、核酸分子、重组载体及其应用，芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术利用芦笋中AoSAP8_P基因的抗逆性与应用，通过该基因转化烟草后的应用，转基因烟草比非转基因烟草耐逆性显著提高，丰富了培育高抗逆性作物的基因资源与应用。本发明专利技术从紫色激情四倍体芦笋品种中克隆出AoSAP8_P基因，成功构建植物过表达载体，本发明专利技术转基因烟草比非转基因烟草耐逆性显著提高。本发明专利技术首次提出并验证AoSAP8_P基因在烟草中的耐逆性功能，丰富了培育强耐逆性作物的基因资源。了培育强耐逆性作物的基因资源。了培育强耐逆性作物的基因资源。

【技术实现步骤摘要】
芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因、核酸分子及其应用


[0001]本专利技术属于是生物基因及其研究应用
，尤其涉及一种芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因、核酸分子及其应用。

技术介绍

[0002]目前，芦笋(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏，属于天门冬科天门冬属，是一种宿根性多年生草本植物。具有较高的营养价值和药用价值。食用部分为芦笋的嫩茎，其嫩茎营养价值较高，富含多种维生素、多种氨基酸及矿物质等营养成分，因而，芦笋的营养价值高于其他蔬菜。更重要的是，芦笋中富含黄酮、甾体皂苷等活性物质，使之具有较高的药用价值，在增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等方面有明显功效。此外，芦笋中还有能有效地防止癌细胞的增值与扩散的组蛋白，能促使细胞正常生长。因而，芦笋是一种食药同源的保健型蔬菜，被称为“蔬菜之王”、“防癌蔬菜”等。芦笋是典型的雌雄异株植物，分为雌株和雄株，也有部分两性株(未完全退化的雌蕊，正常发育的雄蕊，可正常结实)。雌株芦笋枝叶稀疏，发笋数量少，产量低。而雄株芦笋因不结果实(种子)养分消耗少，生长旺盛，枝繁叶茂，发笋多、大、产量高且品质好。因而在同样生长环境下，雄株芦笋比雌株具有更强的抗逆境能力，产量比雌株高许多，导致在育种与生产上希望获得雄株植株材料。
[0003]芦笋中AoSAP8基因，属于A20/AN1型锌指蛋白基因。锌指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)，因含有手指状的锌指结构域而得名。锌指蛋白最初发现于动物中的非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中，后来发现还广泛存在于动植物和微生物的蛋白质中。植物中现已在水稻、拟南芥、小麦、玉米和棉花等多种植物中发现ZFPs。锌指蛋白是植物中最大的转录因子家族之一，可以在转录和翻译水平来调控基因的表达，进而调控植物的生长发育和胁迫应答等。锌指蛋白可根据其二级结构中半胱氨酸(Cys)和/或组氨酸(His)残基的数目和顺序分为很多亚家族，如Cys2/His2型(C2H2)、C2C2、C2C2C2C2、C2HCC2C2型等，目前研究最广泛且成员较多的一类是C2H2型锌指蛋白。近些年来，被研究者们称为胁迫相关蛋白(stress
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associated proteins，SAPs)的锌指蛋白，具有A20和/或AN1型锌指结构域，因此也称为A20/AN1型锌指蛋白。这类蛋白因在功能上有重要性和多样性，迄今为止，在很多植物中的功能分析研究表明该家族蛋白对非生物胁迫产生应答反应。但现有技术中关于植物抗旱性基因的相关研究尚未见报道。因此，亟需确定一种新的植物抗旱性基因。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷转基因插入片段的位置是随机的，无法判断和预测。如果插入到重要的功能位点，可能会造成其他功能的损坏，或者对该研究结果有干扰，比如说转基因植株表现出来的症状该基因的功能还是因为片段的插入造成的。
[0005]解决方法：该实验选择两个转基因株系跟野生型做对比，就能排除上述疑虑。
[0006]现有技术中关于芦笋抗旱性基因的相关研究尚未见报道。
[0007]解决以上问题及缺陷的难度为：通过常规抗旱植株的筛选，周期长，见效慢。
[0008]解决以上问题及缺陷的意义为：该基因可为抗旱育种提供优良抗旱基因。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因、核酸分子、重组载体及其应用。
[0010]本专利技术是这样实现的，一种芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因，所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。涉及的AoSAP8_P基因通过转基因植株的抗旱性证明，转入该基因导致转基因植株的抗旱性增加。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法，所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法包括以下步骤：
[0012]步骤一，分别提取总RNA并检测总RNA的质量后，合成第一链cDNA；
[0013]步骤二，进行AoSAP8_P基因cDNA的克隆和测序：分别进行PCR产物加A反应以及加A后的PCR产物纯化，将cDNA片段与pGEM
‑
T Easy载体连接后，进行菌液PCR检测阳性克隆及测序。
[0014]进一步，步骤一中，所述分别提取总RNA并检测总RNA的质量后，合成第一链cDNA，包括：
[0015](1)总RNA的提取：用镊子采集两性紫芦笋新鲜花蕾迅速置于液氮中，用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA。
[0016](2)检测总RNA的质量：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量；
[0017]将电泳槽、梳子清洗干净，在电泳槽中加入新的50
×
TAE电泳缓冲行液；称取0.25g琼脂糖至三角瓶中，量入25mL 50
×
TAE，置于微波炉中加热2～3min至溶液透明，待溶液冷却至50～60℃后加入2.5μl的核酸染料，充分混合均匀后，快速倒胶；20min琼脂糖胶凝固，小心拔出梳子，取出胶板，放入电泳槽中，取2μlRNA、6μl ddH2O及loading buffer混合进行点样，再点5μl 2000bp Marker。调节电压120V，110mA进行琼脂糖凝胶电泳检测；电泳30min后，置于凝胶成像系统下观察并拍照，检测RNA的完整性以用于反转cDNA。
[0018](3)第一链cDNA的合成：参照试剂公司的反转录试剂盒说明书，进行cDNA合成，用于后面基因PCR扩增，42℃孵育15min，95℃孵育3min使酶灭活后，将得到的cDNA在
‑
20℃保存。
[0019]进一步，步骤二中，所述AoSAP8_P基因cDNA的克隆和测序，包括：
[0020](1)PCR反应体系：以反转录合成的cDNA为模板，用基因特异性引物，利用Phanta Max Super
‑
Fidelity高保真酶扩增cDNA片段；PCR反应程序：预变性95℃处理3min，95℃变性处理15s，58℃退火处理15s，72℃延伸处理5min 40s，处理循环30个；PCR产物胶回收：配置1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在紫外照胶仪的照射下切下条带大小正确的目的基因的胶块，用试剂公司柱式胶回收试剂盒进行目的片段回收。
[0021](2)PCR产物加A反应：高保真DNA聚合酶扩增后的平末端片段要3
’
端加A，从而利于片段与3
’
端为粘性末端的T载体连接；在已灭菌的PCR小管中加入经纯化的平末端cDNA片段15μl，加A反应液4μl，2.5U/μL的Taq酶1μl；加样品后，在手掌型离心机上轻轻混匀，72℃反应30min。
[0022](3)加A后的PCR产物纯化：由于加A反应前已经将PCR扩增产物胶回收成单一条带的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因，其特征在于，所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种应用如权利要求1所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法，其特征在于，所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法包括以下步骤：步骤一，分别提取总RNA并检测总RNA的质量后，合成第一链cDNA；步骤二，进行AoSAP8_P基因cDNA的克隆和测序：分别进行PCR产物加A反应以及加A后的PCR产物纯化，将cDNA片段与pGEM
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T Easy载体连接后，进行菌液PCR检测阳性克隆及测序。3.如权利要求2所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法，其特征在于，步骤一中，所述分别提取总RNA并检测总RNA的质量后，合成第一链cDNA，包括：(1)总RNA的提取：用镊子采集两性紫芦笋新鲜花蕾迅速置于液氮中，用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA；(2)检测总RNA的质量：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量；将电泳槽、梳子清洗干净，在电泳槽中加入新的50
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TAE电泳缓冲行液；称取0.25g琼脂糖至三角瓶中，量入25mL 50
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TAE，置于微波炉中加热2～3min至溶液透明，待溶液冷却至50～60℃后加入2.5μl的核酸染料，充分混合均匀后，快速倒胶；20min琼脂糖胶凝固，小心拔出梳子，取出胶板，放入电泳槽中，取2μlRNA、6μl ddH2O及loading buffer混合进行点样，再点5μl 2000bp Marker；调节电压120V，110mA进行琼脂糖凝胶电泳检测；电泳30min后，置于凝胶成像系统下观察并拍照，检测RNA的完整性以用于反转cDNA；(3)第一链cDNA的合成：参照试剂公司的反转录试剂盒说明书，进行cDNA合成，用于后面基因PCR扩增，42℃孵育15min，95℃孵育3min使酶灭活后，将得到的cDNA在
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20℃保存。4.如权利要求2所述芦笋中抗旱性AoSAP8_P基因的克隆方法，其特征在于，步骤二中，所述AoSAP8_P基因cDNA的克隆和测序，包括：(1)PCR反应体系：以反转录合成的cDNA为模板，用基因特异性引物，利用Phanta Max Super
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Fidelity高保真酶扩增cDNA片段；PCR反应程序：预变性95℃处理3min，95℃变性处理15s，58℃退火处理15s，72℃延伸处理5min 40s，处理循环30个；PCR产物胶回收：配置1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在紫外照胶仪的照射下切下条带大小正确的目的基因的胶块，用试剂公司柱式胶回收试剂盒进行目的片段回收；(2)PCR产物加A反应：高保真DNA聚合酶扩增后的平末端片段要3
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端加A，从而利于片段与3
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端为粘性末端的T载体连接；在已灭菌的PCR小管中加入经纯化的平末端cDNA片段15μl，加A反应液4μl，2.5U/μL的Taq酶1μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：林春，刘正杰，毛自朝，董玉梅，吴贺，杜玥，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：