拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用，是通过创制转基因拟南芥和油菜(Brassica napus)来获取抗病性得到改变的拟南芥和油菜材料中的应用。本发明专利技术首次阐明了该基因对菌核病抗性的强烈调控作用及机制。揭示了该基因对菌核病抗性起正调控作用，并揭示该基因通过调节Ca

【技术实现步骤摘要】
拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用


[0001]本专利技术属生物
，涉及拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用，通过抗菌核病植物种质创制在菌核病防控中的应用。

技术介绍

[0002]1、植物基因表达和基因功能分析技术植物基因的功能通过基因表达和蛋白积累来执行。因此，基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(Phenotype)或功能发挥情况来判断和明确。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(Over
‑
expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过RNA干扰(RNA interfering,RNAi)、基因敲除(Knock
‑
out)等方式来达到。RNAi通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除(Knock
‑
out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。构建基因超表达植株和/或RNAi植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，就能明确目的基因对该性状的调节功能。
[0003]2、植物抗病遗传学调控技术植物抗病性是由植物受体识别病原物配体激活抗病信号传导、活化系列防卫反应而产生的结果。从遗传学上看，受体
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配体识别后，参与抗性调控的基因包括早期抗病信号传导基因和晚期防卫相关基因等。一般来说，利用早期抗病信号传导基因调控植物抗病性的效果较好。钙是第二信使。钙信号途径是公认的关键早期信号传导途径。驱使植物抗病性产生的关键钙信号来自从细胞膜外向细胞质内的迅速和大量的钙内流(Calcium influx)。目前已知激发钙内流的机制来自定位于质膜的钙离子通道，尤其是环核苷酸门控离子通道(Cyclic nucleotide
‑
gated ion channel，CNGC)。CNGC是早期抗病调控基因，利用CNGC基因创制抗病性增强的作物种质具有抗性调控效果好的优点。
[0004]3、菌核病防控技术植物菌核病由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是坏死营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、易使病原物产生抗药性等问题，鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
[0005]4、植物抗病育种技术植物抗病育种技术包括传统抗病育种和通过基因工程抗病育种等。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程
育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一个拟南芥(Arabidopsis thaliana)钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用，所述基因AtCNGC3的核苷酸序列如SEQ ID：1所示，其编码的蛋白序列分别如SEQ ID：2所示。所述拟南芥(Arabidopsis thaliana)钙离子通道基因AtCNGC3对抗病性有调控功能，可在创制抗菌核病(病原物：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))种质中的应用。
[0007]所述应用是通过创制转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油菜(Brassica napus)来获取抗病性得到改变的拟南芥和油菜材料中的应用，其通过创制超表达AtCNGC3的转基因拟南芥来获得增高菌核病抗性的拟南芥材料中的应用，或其通过创制超表达AtCNGC3的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用。
[0008]本专利技术以拟南芥Col
‑
0cDNA为模板，通过PCR克隆获得拟南芥基因AtCNGC3，其核苷酸序列如SEQ ID：1所示，该基因的开放阅读框(ORF)长2121bp，编码的蛋白由706个氨基酸组成，其序列如SEQ ID：2所示。AtCNGC3蛋白包含跨膜结构域、环核苷酸结合结构域和CaM结合结构域，是一个钙离子通道蛋白。本专利技术克隆的核苷酸序列与TAIR序列AT2G46430一致。
[0009]在本专利技术之前，该基因的抗病功能没有任何公开报告。本专利技术首次通过构建该基因的超表达和RNAi转基因拟南芥及其抗病分析，阐明了该基因对核盘菌抗性的调控作用及机制。结果显示，与野生型拟南芥植株相比，突变体植株更感核盘菌(图1)，而超表达转基因植株更抗核盘菌(图2，图3)，说明AtCNGC3正调控拟南芥对核盘菌的抗性。此外，基于Aequorin的Ca
2+
流检测结果显示，三种免疫激发子AtPep1，SsNLP1和SsNLP2在以Atcngc3突变体为背景同时表达了Aequorin基因的植株(Atcngc3
‑
aequorin)激发产生的Ca
2+
流均明显低于以野生型为背景同时表达了Aequorin基因的植株(Col
‑0‑
aequorin)(图4)。表明AtCNGC3具有Ca
2+
通道活性，并正调控免疫激发子诱导的Ca
2+
流。揭示了AtCNGC3通过调节Ca
2+
流调控抗病性的作用机制。
[0010]基于以上本专利技术阐明的AtCNGC3基因功能和机制，本专利技术的应用目的是提供所述的拟南芥AtCNGC3基因通过创制转基因拟南芥来获取抗病性得到改变的拟南芥和作物材料中的应用，包括(1)在通过创制超表达AtCNGC3的转基因拟南芥来获得增强对核盘菌抗性的拟南芥材料中的应用(具体见实施例1中的说明)；以及(2)在通过创制超表达AtCNGC3的转基因油菜来获得增强菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例2中的说明)。
[0011]1.拟南芥AtCNGC3基因在通过创制超表达AtCNGC3的转基因拟南芥来获得增强对核盘菌抗性的拟南芥材料中的应用。通过以下步骤实现：
[0012](1)AtCNGC3基因超表达结构的构建和获取将AtCNGC3基因开放阅读框(ORF)克隆入一个植物表达载体，使其受强本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用，其特征在于，所述基因AtCNGC3的核苷酸序列如SEQ ID：1所示，其编码的蛋白序列分别如SEQ ID：2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是通过创制转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油菜(Brassica napus)来获取抗病性得到改变的拟南芥和油菜材料中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在通过创制超表达AtCNGC3的转基因拟南芥来获得增高菌核病抗性的拟南芥材料中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在通过创制超表达AtCNGC3的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现获得增高菌核病抗性的拟南芥材料中的应用：(1)AtCNGC3基因超表达结构的构建和获取将AtCNGC3基因开放阅读框(ORF)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达；(2)转化AtCNGC3基因超表达结构的农杆菌的获取将构建好的AtCNGC3基因超表达结构通过电击等方法转化对拟南芥具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)超表达AtCNGC3的转基因拟南芥创制和获取通过农杆菌蘸花法将AtCNGC3基因超表达结构导入拟南芥，获取转AtCNGC3基因超表达结构的拟南芥；(4)超表达AtCNGC3的转基因拟南芥纯合系的获取分别以抗生素抗性和AtCNGC3基因表达为检测指标，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡新忠，刘梦娇，易航，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：