猕猴桃转录因子AcARF1基因在抗灰霉病中的应用制造技术

一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明专利技术通过将植物激素生长素途径转录因子AcARF1抑制表达后,通过实验证实抑制表达AcARF1基因能够增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性,具体表现为接种病毒后与对照相比,本发明专利技术获得的转基因果实的发病症状减轻,发病率降低,病菌含量减少,为猕猴桃抗病育种提供重要的基因库及新的种质资源。库及新的种质资源。库及新的种质资源。

【技术实现步骤摘要】
猕猴桃转录因子AcARF1基因在抗灰霉病中的应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种猕猴桃转录因子AcARF1 基因在果实抗灰霉病中的应用。

技术介绍

[0002]猕猴桃(Actinidia Chinensis)营养丰富，素有“水果之王”等美誉。我国是猕猴桃的起源地和主产区，据联合国粮农组织(FAO)统计，2018年我国猕猴桃栽培面积达16.8万公顷，年产量约203.5万吨(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC)。然而猕猴桃果实易遭受多种真菌病原菌的侵害而腐烂变质。由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病通常给猕猴桃产业造成高达30％以上的损失，严重威胁猕猴桃产业的健康发展。目前关于猕猴桃灰霉病的研究主要集中在应用防治、抗病生理及抗病蛋白筛选等方面。国内外关于猕猴桃对灰霉病抗性的分子机制研究相对迟缓，目前对抗灰霉病相关基因功能、调控机制还未见报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供一种猕猴桃AcARF1基因的新应用，该基因能够显著增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性。
[0004]本专利技术目的通过如下技术方案实现：
[0005]一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0006]其中SEQ ID NO.1序列长度:1599bp；组成为436A；341C；385G；437T；百分比:27.3％A；21.3％C；24.1％G；27.3％T。分子量(kDa):ssDNA(单链):494.53 dsDNA(双链):985.71。
[0007]生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)是IAA信号转导的关键因子，本专利技术根据红阳猕猴桃基因组数据库，克隆了猕猴桃AcARF1基因，并采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术鉴定了该基因在灰霉病抗性中的功能。
[0008]采用上述基因编码的蛋白在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且能表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
[0009]本专利技术还提供一种包含上述猕猴桃转录因子AcARF1基因的工程菌。
[0010]一种提高猕猴桃果实抗灰霉病的方法，其特征在于：包括(1)构建含有 AcARF1基因的重组表达载体，所述AcARF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01 所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示；(2)将构建的重组表达载体转化到植物组织或细胞中；(3)培育筛选得到抗灰霉病的转基因植株。
[0011]本专利技术具有如下有益效果：
[0012]本专利技术通过将植物激素生长素途径转录因子AcARF1抑制表达后,通过实验证实抑制表达AcARF1基因能够增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性,具体表现为接种病毒后与对照相比,本专利技术获得的转基因果实的发病症状减轻,发病率降低,病菌含量减少,为猕猴桃抗病育种提供重要的基因库及新的种质资源。
附图说明
[0013]图1：本专利技术AcARF1基因在转基因农杆菌侵染猕猴桃后对照组中的表达量。
[0014]图2：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染的表型观察。
[0015]图3：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天的病斑面积统计。
[0016]图4：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天POD活性变化。
[0017]图5：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天SOD活性变化。
[0018]图6：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天总酚含量变化。
具体实施方式
[0019]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本领域技术人员理解本专利技术，但本专利技术不限于具体实施方式的范围。
[0020]以下实施例中涉及的各载体、猕猴桃品种
‘
红阳
’
猕猴桃，以及各种试剂均为市售，猕猴桃灰葡萄孢菌菌株由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供(ACCC CAASF
‑
122)。
[0021]实施例1猕猴桃转录因子AcARF1基因的获得
[0022]采用RNAiso Plus Kits(Takara,Japan)提取猕猴桃总RNA,采用TransScriptAll
‑
in
‑
One First
‑
Strand cDNA Synthesis Supermix for qPCR(One
‑
Step gDNA Removal) Kit(TransGen，China)反转录合成cDNA,总RNA采用Takara isoplus试剂盒提取。猕猴桃叶加入液氮研磨成粉，装入RNase
‑
free的1.5ml离心管中，加入1mlFruitmate(Takara)试剂颠倒混匀后于4℃
×
12000g离心5min，将600μl上清液转移至新管，加入600μl RNAiso Plus，静置5min后4℃
×
12000g离心5min。将上清液转移到新管中加入300μl氯仿颠倒混匀，静置5min，4℃
×
12000g离心15min。将上清液转移至新的离心管，加600μl异丙醇混匀后静置10min，4℃
×
12000g离心10min。弃上清，沉淀中加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀4℃
×
7500g 离心5min，弃上清并风干。加入30μl RNase
‑
free ddH2O溶解沉淀。对所得的 RNA进行琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中进行成像分析。以总RNA为实验模板，采用全式金TransScript OneStep gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒合成反转录产物。1.5ml的离心管中依次加入10μl 2
×
ES ReactionMix,5μl Total RNA，2μl RNase
‑
free Water,1μl gDNA Remover,1μlEasyScript@RT/RI Enzyme，1μl Oligo(dT)，42℃孵化30min，再于85℃孵化5 s以终止反应。置于
‑
20℃冰箱保存。
[0023]采用如下引物序列进行PCR扩增：
[0024]上游引物：atgattacgtttatagattcgaaagat(SEQ ID NO.3)
[0025]下游引物：caatccccactcaacattc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列或SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SEQIDNO.1序列组成为436A;341C;385G;437T；百分比:27.3%A;21.3%C;24.1%G;27.3%T；分子量(kDa):ssDNA（单链）:494.53dsDNA（双链）:985.71。3.采用如权利要求1所述AcARF1基因编码的蛋白在猕猴桃...

【专利技术属性】
技术研发人员：李哲馨，唐建民，杨帅，廖钦洪，兰建彬，
申请(专利权)人：重庆文理学院，
类型：发明
国别省市：