一个低温致死和高温响应水稻叶色突变基因及其检测方法和应用技术

在本发明专利技术公开一种可对低温致死和高温响应水稻叶色突变基因片段进行特异性扩增的特异性引物，根据扩增后测序得到的序列与亲本进行序列对比，即可检测出低温致死和高温响应水稻叶色突变基因，其检测精确度高，操作方便，成本低廉。本低廉。本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一个低温致死和高温响应水稻叶色突变基因及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及农业和植物生物技术等领域，尤其是在分子水平进行水稻遗传育种以及基因功能、生理等基础研究。
[0002]技术背景
[0003]叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，所以叶色是辨别判断植物生长状况、植物突变最简单和直观单的标准之一。在实际应用中，叶色不仅可用于观赏植物新特品种的选育，还可以作为很多农作物如小麦、水稻、玉米等最理想的形态学标记，还可用于植物的遗传育种、生理生化机制及其相关基因的克隆和功能研究之中。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等技术已创制大量水稻叶色突变体，根据它们是否受温度调控,又分为高温表达型、低温表达型和温度钝感型等的叶色突变体。本研究利用
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Coγ射线诱变处理创制的低温致死和高温响应水稻叶色基因突变株，并通过图位克隆技术定位到一个低温致死和高温响应水稻叶色突变基因新基因。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一个低温致死和高温响应水稻叶色突变基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。
[0005]低温致死和高温响应叶色变化的水稻来源于经
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Co γ射线处理的粳稻嘉花1号的诱变产生的群体后代，经多次自交繁殖和选择，该水稻性状和各种农艺性状均已稳定。以该水稻材料与籼稻品种广亲和培矮 64S 杂交后的F2代分离群体作为定位群体，利用DNA分子标记将低温敏感型水稻叶色的基因定位在水稻第3号染色体上。
[0006]携带该低温致死和高温响应水稻叶色突变基因水稻植株在20℃以下生长的条件下表现为白化，继而在四叶期后死亡；在32℃培育下表现为白化，三叶期后复绿继续存活。该基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述的基因编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0007]一对用于检测上述基因的特异性引物，序列为：上游：5
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GTTTGAAGAGATGAAGAACAGTG
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下游：5
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CTTTTTTATGTCACCTTGCTTGC
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即SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4检测该低温致死和高温响应水稻叶色突变基因的方法为，采用上述特异性引物（SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4）对水稻提取DNA进行扩增，得到409bp核苷酸序列。SEQ ID No.5 和SEQ ID No.6的序列分为亲本和低温致死和高温响应水稻叶色突变基因水稻的所示。由携带低温致死和高温响应水稻叶色突变基因的水稻DNA扩增得到的408bp片段中，在172bp处缺失一个碱基G。
[0008]在本专利技术中，专利技术人设计了一种可对低温致死和高温响应水稻叶色突变基因片段进行特异性扩增的特异性引物，根据扩增后测序得到的序列与亲本进行序列对比，即可检测出低温致死和高温响应水稻叶色突变基因，其检测精确度高，操作方便，成本低廉。
[0009]附图说明
[0010]图1为本专利技术具有低温致死和高温响应水稻叶色突变基因水稻在20℃（左）和32℃（中）以及野生型（右）苗期表型；图2为本专利技术对PCR的引物扩增产物与野生型水稻进行序列比对检查结果。
具体实施方式
[0011]实施例1 水稻DNA提取
•
取新鲜的苗期水稻叶片，将叶片剪成0.5cm长的小段，放入预冷的研钵中，加入液氮将其研磨至粉末状，转入2mL离心管中加入1mL60℃预热的2%CTAB（破坏细胞膜）溶液，轻轻震荡后60℃水浴45min，期间多次震荡。
[0012]•
取出离心管，冷却至室温，12000r/min 20℃条件下离心5min，吸取600μL上清液,并加入等体积的氯仿
‑
异戊醇（24:1）混合液，充分混匀。
[0013]•
将含有溶液的离心管进行平衡，12000r/min 20℃离心5min，吸取600μL上清液，加入其2/3体积（400μL）异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。
[0014]•
12000r/min 20℃离心3min,使核酸沉淀，弃上清。
[0015]•
加入70%乙醇洗涤，12000r/min 20℃离心5min，弃上清。
[0016]•
重复步骤5
•ꢀ
室温干燥后溶于150μL的无菌水中。
[0017]•
取2μL用于后续的PCR扩增反应。
[0018]实施例2获得低温致死和高温响应水稻叶色突变基因及其氨基酸序列25μL PCR反应体系如下：100mM Tris
‑
HCl pH9.0;100mM KCl;20mM MgSO4;80mM (NH4)SO4;2.5Mm Dntp;10μM引物，5U/μL Taq酶，1μL模板DNA。
[0019]引物序列为：上游：5
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ggatcttccagagatCTCCTGTTCCCCTCTGCCTG
ꢀ‑3’
下游：5
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ctgccgttcgacgatGGAAAAAAAATAGACTGAAGTATAACTCAGA
‑3’
PCR扩增反应。
[0020]PCR扩增产物长度为5627bp,用Bioxm软件与http://rice.plantbiology.msu.edu/网页下载得到的基因序列与测序结果比对，其片段结果如SEQ ID No.1，根据其所得结果查阅可得该序列翻译所得氨基酸结果如SEQ ID No.2。
[0021]（二）检测受温度调控水稻叶色的基因1. 25μL PCR反应体系如下：100mM Tris
‑
HCl pH9.0;100mM KCl;20mM MgSO4;80mM (NH4)SO4;2.5Mm Dntp;10μM引物，5U/μL Taq酶，1μL模板DNA。
[0022]特异性PCR引物序列如下：
上游：5
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GTTTGAAGAGATGAAGAACAGTG
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下游：5
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CTTTTTTATGTCACCTTGCTTGC
ꢀ‑3’
2. PCR扩增反应。
[0023]得到的扩增产物，经溴酚蓝染色，上样于经溴化乙锭染色的1.5%的琼脂糖凝胶上并电泳，在UVP凝胶成像仪上成像，出现408bp条带并将其扩增产物送测。利用BioXM软件将得到的序列与亲本序列进行比较，其结果如图2所示，序列如SEQ ID No.6所示，是SEQ ID No.1中的一段。
[0024]实施例4 功能基因验证受低温致死和高温响应叶色突变基因水稻来源于经
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Coγ射线处理的粳稻嘉花1号的诱变产生的群体后代，经多次自交繁殖和选择，该突变性状和各种农艺性状均已稳定。携带该基因的水稻植株在20℃条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.低温致死和高温响应水稻叶色突变基因，其特征在于，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的低温致死和高温响应水稻叶色突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.权利要求1或2所述的基因序列所编码的蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID No.2所示的742个氨基酸序列。4.权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。5.一对用于检测权利要求1或2所述的低温致死和高温响应水稻叶色突变基因的特异性PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列为：上游：5'
‑ꢀ
GTTTGAAGAGATGAAGAACAGTG
ꢀ‑
3'（SEQ ID No.3）下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑜，高媛媛，林冬枝，董彦君，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：