一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，属于免疫细胞治疗技术领域。本发明专利技术的方法包括：携带抑制免疫负调控基因siSOCS1及CA9目的基因的rAAV2

【技术实现步骤摘要】
一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法


[0001]本专利技术属于免疫细胞治疗
，具体涉及一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法。本专利技术的细胞毒性T淋巴细胞是由经携带免疫负调控基因SOCS1基因及碳酸酐酶IX基因的rAAV2修饰的树突状细胞激活的，具有CA9肿瘤抗原特异性，可用于抗肾细胞癌的免疫细胞治疗。

技术介绍

[0002]成人肾脏中最常见的占位性病变—肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）约占所有肿瘤2%，且在全世界范围内每年以1.5
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5.9%增长。部分患者首诊时已是晚期或发生远端转移，且肾癌具有多重耐药基因对放疗、化疗不敏感，愈后较差，中位生存时间<12个月，5年生存率<10%。目前，手术切除是最好的治疗方法，但棘手的是，微小和转移病灶难以手术切除，术后患者复发率高达20%
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40%；此外，部分患者采用IL
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2，IFN
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α等细胞因子治疗有效，但药物的毒性作用十分明显。
[0003]RCC的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关。特别是RCC患者到了晚期，患者体液免疫与细胞免疫功能普遍低下，RCC细胞无法被T细胞识别、杀伤。由于荷瘤宿主的树突状细胞（dendritic cell, DC）数量少，无法有效递呈RCC抗原，且RCC细胞分泌VEGF、IL
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10、TGF
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β、PGE2等细胞因子和粘附分子，使树突状细胞的成熟分化停留在幼稚阶段或向其他内皮细胞转化，MHC
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II类分子及某些共刺激分子的低表达，从而使得 DC严重降低甚至失去其抗原递呈及激活T细胞的能力。
[0004]目前体外实验证实，分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应能力。因此肿瘤过继性免疫细胞疗法（DC/CTL）有望成为较好的RCC治疗方法，其作用机制是DC体外荷载RCC抗原，并通过MHC/抗原肽
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TCR的相互作用激活特异性CTL，回输机体启动抗RCC免疫应答，清除RCC。目前常采用肿瘤细胞裂解物负载DC，但其有不足，非肿瘤相关抗原种类多，易诱发自身免疫病，且多抗原亦导致免疫原性低；另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原肽致敏DC，其特异性好，可多次免疫，但也存在不足，抗原肽价格一般较贵、半衰期短，需多次免疫才能获得良好的CTL。
[0005]对于负载DC的研究日渐深入，研究人员发现通过制备转基因DC并体外诱导CTL，可促进CTL充分发挥抗肿瘤作用。与肿瘤全抗原、抗原裂解物相比，肿瘤转基因制备的DC/CTL特异性更好，抗肿瘤免疫反应更强；与肿瘤抗原肽相比，肿瘤转基因可持续表达，有效降低DC/CTL制备成本。目前rAAV因具有感染能力强、安全性好、免疫源性低和体内长时间表达外源基因等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。基于DC的肿瘤细胞靶向治疗技术（anti
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cancer cellular immunotherapy, ACTL）是通过基因重组改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的rAAV转导DC，刺激产生特异性杀伤肿瘤细胞的CTL。研究表明，CTL反应能力方面，带抗原的rAAV优于蛋白质负荷，其转染DC效率高达90%以上，且具有上调DC的功能。
[0006]肿瘤转基因制备DC/CTL方法安全且副作用少，对微小和转移病灶的RCC更有传统
手段无可比拟的高度靶向性。但实际运用中，仅通过抗原负载的DC/CTL往往不能激发足够强大的抗瘤免疫应答，所以治疗效果不如预期理想。这是由于为躲避宿主免疫系统攻击，肿瘤发展出多种多样的逃逸机制，在抗原提呈阶段，就可能存在肿瘤抗原免疫原性低下、MHC分子表达减少、协调刺激分子缺失、分泌抑制性细胞因子等因素。因此，必须采取一定的方法来修饰、处理DC，增强其抗原提呈、启动T细胞免疫的能力。
[0007]细胞因子信号传导抑制因子
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1（suppressor of cytokine signaling
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1, SOCS1）是JAK
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STAT信号传导途径的负调节蛋白，负反馈调节细胞因子信号通路和TLR信号通路，能够抑制IL、IFN等多种因子的细胞内信号传导。通过沉默或干扰SOCS1基因的表达，可促进DC成熟，改变肿瘤耐受状态。Chen等提出了通过抑制免疫负调控因子（inhibition of antigen
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presentation attenuator, iAPA）来增强DC功能。iAPA是一种新型的肿瘤免疫细胞治疗技术，其核心是采用小干扰核糖核酸（siRNA）特异性阻断DC中关键的负调控因子，使其基因表达沉默，诱导机体突破自身对肿瘤的免疫耐受，增强抗原特异性免疫反应，进而提高肿瘤免疫治疗的临床疗效。
[0008]此外，碳酸酐酶IX（CAIX或CA9）是分布于细胞膜和细胞核膜上的糖蛋白。Oosterwi JK等首先获得鼠源的CA9单抗，利用单抗对多数类型的RCC进行免疫组化，88%有该抗原表达，而多数组织不表达。该基因位于9p12
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13，共10898bp，与MN及G250基因同源且基因构象相同，其表达的蛋白分布于细胞膜和细胞核膜上，成熟体是由459个氨基酸编码的糖蛋白，其中38个氨基酸(aal
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37）构成N末端信号肽（SP），377个氨基酸（aa38
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414）构成细胞外区，20个氨基酸（aa415
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434）构成跨膜区，25个氨基酸（aa435
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459）构成细胞内的C末端。细胞外区又分两个部分：蛋白多糖区（PG）和碳酸酐酶区（CA）。其中CA区位于细胞膜，含有257个氨基酸（aal35
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391），在SP和CA之间的59个氨基酸（aa53
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111）与人类角质素黏附区有38％的同源性。因此，肿瘤相关抗原CA9可作为RCC肿瘤标志物。
[0009]基于以上技术研究成果，免疫杀灭RCC细胞应是一种非常有前景的治疗手段，其关键在于对刺激DC抗原的选择及方法的优化，从而实现增强DC，启动T细胞特异性免疫。ACTL技术赋予DC/CTL高度靶向性，iAPA技术可有效解决机体自身耐受问题，显著提高DC抗原提呈能力，二者若能联合运用，有望显著增强DC/CTL的抗原特异性免疫反应。本研究采用rAAV2介导RNAi下调SOCS1基因表达，联合CA9及S
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Flagellin刺激DC细胞成熟，诱导特异性的DC/CTL特异性杀伤抗CA9阳性RCC。其意义在于，有效的增强CTL对RCC的靶向性，避免对自体细胞的损伤，在临床上，应用iAPA技术，可以有效的抑制肿瘤的生长，避免细胞发生远端转移，延长患者生存期。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于针对现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）携带siSOCS1及CA9目的基因的rAAV2
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siSOCS1
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CA9重组病毒载体的制备；（2）rAAV2
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siSOCS1
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CA9重组病毒载体感染、分化、诱导DC细胞成熟，得iAPA
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CA9
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DC细胞；（3）iAPA
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CA9
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DC细胞与T细胞混合培养，获得iAPA
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CA9
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DC/CTL细胞，即肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：步骤（1）中所述携带目siSOCS1及CA9的目的基因序列依次为：U6启动子序列、SOCS1 siRNA序列、SOCS1 siRNA反向序列、CMV启动子序列、CA9蛋白基因序列、IRES序列、Flagellin鞭毛蛋白基因序列；所述SOCS1 siRNA序列如SEQ ID NO.1所示，SOCS1 siRNA反向序列如SEQ ID NO.2所示，SOCS1 siRNA序列和SOCS1 siRNA反向序列，两段序列反向互补；目的基因与2型腺相关病毒载体AAV2组装获得rAAV2
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siSOCS1
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CA9重组病毒载体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：段训威，肖桂清，杨槟煌，王礼兴，陈怀宇，吴文林，
申请(专利权)人：泉州师范学院，
类型：发明
国别省市：