一种可用于活体检测细胞类型特异神经连接的rAAV及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可用于活体检测细胞类型特异神经连接的重组腺相关病毒，及其在神经结构环路示踪中的应用。将携带cre依赖表达的1型水通道蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的AAV2

【技术实现步骤摘要】
一种可用于活体检测细胞类型特异神经连接的rAAV及其应用


[0001]本专利技术属于病毒载体
，具体涉及一种携带cre依赖表达的1型水通道蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组腺相关病毒，及其在神经结构环路示踪及功能解析中的应用。

技术介绍

[0002]大脑是一个复杂而又精细的系统，它是个体的信息处理控制核心。人类大脑中含有数百亿个神经元，其中包含成百上千种细胞类型，神经元之间通过突触连接形成了庞大的神经网络，构成了大脑处理信息、调控行为的结构基础。解析不同细胞类型的神经元亚群在神经网络中扮演的角色，揭示特定类型神经元在特定脑区的数目、定位、形态、输入/输出连接以及相应的生理功能，是理解大脑工作的神经机制的关键。
[0003]利用携带报告基因的嗜神经工具病毒，感染神经元并标记大脑的神经网络，是目前常用的示踪结构神经网络的技术。工具病毒载体不仅可介导外源基因在多种类型的细胞中稳定高效地表达，还可通过分子元件限制外源基因在特异类型细胞中表达，因此可用于标记细胞类型特异的神经网络，有利于精细地解析神经网络。
[0004]重组腺相关病毒(recombinant Adeno
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Associated Virus,rAAV)是一类常用于神经环路示踪的病毒载体，它具有多种衣壳蛋白，对应着多种血清型，不同血清型AAV感染特性不同。其中rAAV2
‑
retro(简称retro)血清型AAV可通过轴突末梢进入神经元，逆向运输到达神经元胞体并转导外源基因，可用于标记神经纤维直接投射到特定脑区的上游网络。相对于其他标记上游神经连接的病毒载体，rAAV2
‑
retro具有毒性低、外源基因表达稳定持久、生物安全性高(可与活体MRI扫描兼容)等优势。通过结合Cre
‑
loxP系统，AAV携载的外源基因可在特定类型神经元的特异表达，有利于细胞类型特异的神经网络研究。例如，可在rAAV基因组中插入DIO元件以使外源基因的表达受到cre重组酶的控制。DIO元件为Double
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floxed Inverse Orientation，是由两种不同的LoxP位点组成，在没有Cre重组酶的情况下，目的基因不表达，在有Cre的情况下，目的基因被翻转至正确的方向，才能开始表达。
[0005]然而，现有的嗜神经病毒常携带荧光蛋白基因，获得的标记结果多由离体的荧光图像呈现，难以实现在活体水平的全脑结构神经网络的解析。发展高效的活体检测全脑结构神经网络的方法仍是神经网络研究中的一大挑战，发展在活体水平检测细胞类型特异的神经连接的方法更是其中的难点。
[0006]磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)是一种综合了非侵入性、无电离辐射、高穿透性、适用于软组织等多种优势的成像方法，已被广泛运用于临床诊断与科学研究。编码可被MRI检测的蛋白质的基因被称为MRI报告基因。MRI报告基因目前多用于在活体动物内监测基因表达、细胞迁移等过程。水通道蛋白1(AQP1)基因是近年来报道的一种新型MRI报告基因。它的表达产物水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是一组对水有高度选择通透性的跨膜转运蛋白。过表达AQP1蛋白可影响水分子跨细胞膜扩散率，在细胞及活体组织中产生显著的扩散加权成像(Diffusion weighted imaging，DWI)信号的改变，在DWI
‑
MRI图像中
呈现暗信号，在表观扩散系数(Apparent Diffusion Coefficient，ADC)map中呈高信号。相较于其他MRI报告基因，AQP1具有不依赖金属离子、灵敏度高、无明显细胞毒性等多种优势。
[0007]综上所述，通过rAAV2
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retro载体携带MRI报告基因AQP1，可能实现基于MRI的神经连接活体检测，再结合Cre
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loxP系统，可使rAAV2
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retro介导的AQP1表达靶向特定细胞类型神经元，从而可能在活体水平检测特定细胞类型的神经连接。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种可用于活体检测细胞类型特异的神经连接的重组腺相关病毒载体。
[0009]本专利技术的另一个目的在于提供可用于活体检测细胞类型特异的神经连接的重组腺相关病毒载体在神经结构环路示踪中的应用。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]重组腺相关病毒核心质粒：核心质粒携带cre依赖表达的水通道蛋白AQP1基因、荧光蛋白报告基因的表达框。具体地，该质粒是在rAAV载体质粒的ITR中间依次插入CAG启动子(SEQ ID NO.1所示)、DIO元件(SEQ ID NO.2所示)、AQP1基因(SEQ ID NO.3所示)、2A连接序列(SEQ ID NO.4所示)、EGFP基因(SEQ ID NO.5所示)、WPRE转录后调控元件(SEQ ID NO.6所示)以及polyA序列(SEQ ID NO.7所示)，构建重组腺相关病毒核心质粒pAAV
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CAG
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DIO
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AQP1
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2A
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EGFP
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WPRE
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pA。
[0012]重组腺相关病毒：该病毒是以pAAV
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CAG
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DIO
‑
AQP1
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2A
‑
EGFP
‑
WPRE
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pA为核心质粒制备重组腺相关病毒，具体方法为：将包装rAAV所需的辅助质粒、rAAV2
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retro(简称retro)血清型质粒、核心质粒共同转染HEK293T细胞，收集离心后的细胞沉淀纯化重组腺相关病毒rAAV2
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retro
‑
CAG
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DIO
‑
AQP1
‑
2A
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EGFP
‑
WPRE
‑
pA。
[0013]上述重组腺相关病毒在活体水平检测细胞类型特异神经连接中的的应用：将该重组腺相关病毒注射在cre转基因小鼠的大脑中，病毒感染神经元并在神经元中介导AQP1蛋白表达，通过磁共振成像DWI方法观察活体大脑，在活体大脑中显示其他脑区与注射位点被感染神经元之间的细胞类型特异的神经连接，具体细胞类型由转基因小鼠cre品系决定。在本专利技术的具体实施方式中，将重组腺相关病毒rAAV2
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retro
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CAG
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DIO
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AQP1
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2A
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EGFP
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WPRE
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pA注射在Thy1
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cre转基因小鼠的A脑区，经过一段时间后，DWI
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组腺相关病毒核心质粒，其特征在于，所述的核心质粒携带cre依赖表达的水通道蛋白AQP1基因、荧光蛋白报告基因的表达框。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒核心质粒，其特征在于，在rAAV载体质粒的ITR中间依次插入CAG启动子、DIO元件、AQP1基因、2A连接序列、EGFP基因、WPRE转录后调控元件以及polyA序列，构建重组腺相关病毒核心pAAV
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CAG
‑
DIO
‑
AQP1
‑
2A
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EGFP
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WPRE
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑宁，王杰，桂竹，吴阳，徐富强，
申请(专利权)人：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：