一种rAAV载体核心质粒及其应用制造技术

发明专利技术公开了一种rAAV载体核心质粒及其应用，所述rAAV载体核心质粒主要含有荧光蛋白基因和荧光素酶基因的双报告融合基因，特定AAV血清型Cap基因对应的识别性DNA序列。利用该rAAV载体核心质粒包装出的rAAV感染细胞，通过检测荧光蛋白或荧光素酶报告基因的表达，从而快速测定多种不同血清型rAAV的感染活性；此外，还可以通过对感染细胞中的特定AAV血清型Cap基因所对应的识别性DNA序列或其转录产物进行检测和丰度分析，用于同时评价多种不同血清型rAAV的感染效率差异。清型rAAV的感染效率差异。

【技术实现步骤摘要】
一种rAAV载体核心质粒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒载体
，更具体地，涉及一种快速检测rAAV生物活性的rAAV载体及其应用。

技术介绍

[0002]重组腺相关病毒载体(rAAV)是由野生型腺相关病毒(AAV)改造而来，rAAV基因组仅包含AAV两端的末端重复序列(ITR)，所含外源基因完全替代了病毒自身编码基因。通过在包装细胞系中反式补偿AAV的复制基因Rep、结构基因Cap和包装辅助基因可制备获得rAAV。由于它具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、病毒血清型种类多、可感染分裂和非分裂细胞、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，在生物医学研究领域是一种广泛用于携载外源基因表达的重要病毒工具，在疾病基因治疗领域是非常重要病毒载体(Wang Det al.,Nat Rev Drug Discov.2019；18(5):358
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378)。迄今，已经有3种基因rAAV的基因治疗药物上市。
[0003]目前，从自然界中分离的AAV主要有13种血清型以及100多种突变亚型。不同血清型AAV病毒衣壳蛋白(Cap)的多样性决定了AAV感染性差异。这些感染特性涉及AAV感染细胞的吸附与进入，细胞内转运，细胞核内的病毒脱衣壳，以及转基因表达。已经发现了一些细胞表面的AAV特异性受体，如：硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、整合素等。不同血清型AAV的衣壳蛋白及其细胞表面受体存在差异，表现出了多种不同的感染效率、组织或细胞类型的趋向性和免疫特性。通过对AAV衣壳蛋白Cap基因进行突变改造，可以获得一些具有优良新特性的rAAV载体。例如：在肝脏中转导活性显著提高的AAV
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DJ型，能够高效穿越小鼠大脑血脑屏障的AAV9
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PHP.eB型等。
[0004]测定不同血清型rAAV的感染活性及其对不同组织细胞感染效率的差异，对于更好的应用rAAV非常重要。由于包装与纯化方法工艺、生产批次、储存条件等的差异能够对rAAV病毒类载体的感染活性造成很大的影响，而rAAV载体的总颗粒数受存储条件等的影响较小。目前，广泛采用的rAAV的物理滴度(病毒颗粒浓度)通常是利用荧光实时定量PCR的方法(Q
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PCR)来测定，rAAV病毒颗粒只含有单个拷贝的基因组DNA，因此rAAV的物理滴度可定义为每毫升rAAV病毒基因组的拷贝数，即(vector genome per ml，vg/ml)。rAAV的感染活性常用转导滴度(Transducing titer，单位是TU/ml)或感染滴度(Infectious titer，IU/ml)表示。rAAV2标准品的感染活性测定方法是在5型腺病毒(AdV5)的辅助感染下，利用梯度稀释的rAAV样品感染整合了AAV2的Cap和Rep基因的Hela RC32细胞系，通过观察荧光蛋白报告基因的表达或定量PCR获得AAV基因组拷贝数计算TCID50的方法来测量(参考Lock M et al.,2010Human Gene Therapy,21(10):1273
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85)。该方法需要特殊的Hela RC32细胞系以及有一定安全性风险的5型腺病毒的辅助感染，难以普通推广。近年来，也有一些研究者利用在rAAV基因组中携带荧光素酶(luciferase，Luc)测定rAAV的感染活性，但往往局限于少数几种血清型rAAV活性的检测，通用性不高、获得的数据缺乏可比性。
[0005]因此，开发适合于各种血清型的，多参数、具有可比性的快速灵活的检测rAAV的感
染活性的新方法，对于rAAV制品的质量控制以及rAAV在基因治疗基础与临床研究中都具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的上述缺陷或改进需求，本专利技术提供的一种新的rAAV载体核心质粒含有荧光蛋白基因和荧光素酶基因的双报告融合基因以及特定AAV血清型Cap基因所对应的性DNA序列，通过检测荧光蛋白基因或荧光素酶报告基因的表达，可用于快速测定多种不同血清型rAAV感染活性，还可以同时评价多种不同血清型rAAV的感染效率差异。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种rAAV载体核心质粒，所述rAAV载体核心质粒表达元件依次整合CMV启动子，荧光蛋白基因和荧光素酶基因的双报告融合基因，转录后调控序列WPRE，人生长激素polyA元件，以及插入在WPRE和人生长激素polyA元件之间的特定AAV血清型衣壳蛋白Cap基因所对应的识别性DNA序列。所述rAAV载体核心质粒通过广谱强启动子CMV高效表达含有荧光蛋白基因和荧光素酶基因的双报告融合基因。NanoLuc是近年来开发新型的萤光素酶，相比其他的荧光素酶，它发光更亮、分子量更小(仅含171个氨基酸，分子量为19.1kDa)，是目前性能最优良的生物发光报告基因之一，我们将NanoLuc基因通过连接序列连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因的C端，获得了兼具两者优点的EGFP
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NanoLuc双报告融合基因，既可以通过荧光显微镜观察EGFP的表达，又可以通过荧光素酶检测仪定量检测NanoLuc的表达，既适用于体外培养的组织细胞，也适用于动物活体检测。利用转录后调控序列WPRE，人生长激素polyA(HGHpA)元件进一步提高双报告融合基因的表达水平。特别是在WPRE和HGHpA元件之间通过多克隆酶切位点(MCS)可以灵活引入特定AAV血清型Cap基因对应的识别性DNA序列。
[0009]优选地，所述的特定AAV血清型衣壳蛋白Cap基因所对应的识别性DNA序列具体为：以特定AAV血清型的衣壳蛋白Cap基因的第1760位碱基(约为Cap基因编码的Cap衣壳蛋白第587位氨基酸附近)为中心位点，向该中心位点的3
′
末端和5
′
末端各延伸250
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400bp，基本上处于Cap基因序列的主要可变区。具体地，AAV2血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.3所示的序列；AAV9血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.4所示的序列；AAV13血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.5所示的序列。
[0010]优选地，以pFast.Bac.Dual穿梭质粒作为载体骨架。既可以直接通过质粒转染HEK293细胞的方法包装制备出rAAV，也可以通过构建到重组杆状病毒(BEV)，利用BEV感染昆虫Sf9细胞的方法制备出rAAV。
[0011]上述rAAV载体核心质粒在检测不同血清型rAAV的感染活性中的应用，包括以下步骤：
[0012](1)利用上述的rAAV载体核心质粒制备获得与其携带识别性DNA序列相对应的特定血清型的rAAV；
[0013](2)将步骤(1)中制备得到的特定血清型rAAV病毒，按照一定的比例梯度稀释后感染96孔板中培养的细胞；
[0014](3)感染2天后，通过观察荧光蛋白报告基因的表达，或检测荧光素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种rAAV载体核心质粒，其特征在于，所述rAAV载体核心质粒表达元件依次整合CMV启动子，荧光蛋白基因和荧光素酶基因的双报告融合基因，转录后调控序列WPRE，人生长激素polyA元件，以及插入在WPRE和polyA元件之间的特定AAV血清型衣壳蛋白Cap基因所对应的识别性DNA序列。2.根据权利要求1所述的rAAV载体核心质粒，其特征在于，所述的特定AAV血清型衣壳蛋白Cap基因所对应的识别性DNA序列具体为：以特定AAV血清型的衣壳蛋白Cap基因的第1760位碱基为中心位点，向该中心位点的3
′
末端和5
′
末端各延伸250
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400bp。3.根据权利要求1所述的rAAV载体核心质粒，其特征在于，AAV2血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.3所示；AAV9血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.4所示；AAV13血清型Cap基因的识别性DNA序列如SEQ ID No.5所示。4.根据权利要求1所述的rAAV载体核心质粒，其特征在于，以pFast.Bac.Dual穿梭质粒作为载体骨架。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳，徐富强，王杰，韩增鹏，王起恬，金鼎瑜，骆能松，
申请(专利权)人：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：