采用工程化RNA利用内源ADAR进行靶向的RNA编辑制造技术

本申请提供了通过在宿主细胞中引入脱氨酶募集RNA以使靶RNA中的腺苷脱氨来编辑RNA的方法。本申请还提供了用于RNA编辑方法的脱氨酶募集RNA以及包含其的组合物和试剂盒。酶募集RNA以及包含其的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】采用工程化RNA利用内源ADAR进行靶向的RNA编辑
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年7月12日提交的国际专利申请号PCT/CN2019/095802的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]ASCII文本文件序列表的提交
[0004]以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：FD00254PCT
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ST25.txt，记录日期：2020年7月10日，大小：16KB)。
专利

[0005]本公开总体涉及使用工程化的RNA来编辑RNA的方法和组合物，所述工程化的RNA能够募集腺苷脱氨酶以使靶RNA中的一个或多个腺苷脱氨。
[0006]专利技术背景
[0007]基因组编辑是用于疾病的生物医学研究和治疗开发的强大工具。使用工程化的核酸酶(如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR系统的Cas蛋白)的编辑技术，已被应用于操纵多种生物体中的基因组。最近，利用脱氨酶蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dRNA还包含3
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连接序列和5
′
连接序列，任选地其中：(i)所述3
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连接序列和所述5
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连接序列至少部分地彼此互补；和/或(ii)所述3
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连接序列和所述5
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连接序列的长度为约20个至约75个核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dRNA是环状RNA。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述dRNA被RNA连接酶RtcB环化，任选地其中所述RNA连接酶RtcB在所述宿主细胞中内源性表达。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列，任选地其中：(i)所述3'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5'扭转酶序列是扭转酶P1；或(ii)所述5'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3'扭转酶序列是扭转酶P1。8.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；并且其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。9.根据权利要求8所述的方法，其中：(i)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)；(ii)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)；(iii)所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸；(iv)所述3
′
snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列；(v)所述5
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snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列；和/或(vi)所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列、H/ACA盒snoRNA序列、复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列、或孤儿snoRNA序列。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。11.根据权利要求6
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7或10的方法，其中所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子，并且其中所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。12.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述Pol II启动子是CMV启动子，任选地其中所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。14.根据权利要求6
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7和10
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13中任一项所述的方法，其中所述构建体是病毒载体或质粒，任选地其中所述构建体是AAV载体。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述ADAR由所述宿主细胞内源性表达，任选地其中所述宿主细胞是T细胞。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中：(i)所述靶向RNA序列的长度大于50个核苷酸，任选地其中所述靶向RNA序列的长度为约100个至约150个核苷酸；(ii)所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷，任选地其中所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷错配，诸如其中所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列3'端至少20个核苷酸，并且距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸；(iii)所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷，它们各自与所述靶RNA中的非靶腺苷相对；(iv)所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续的错配核苷酸；(v)所述靶RNA中靶腺苷的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶RNA中靶腺苷的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U；(vi)所述靶RNA中所述靶腺苷在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU，任选地其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述靶向RNA包含与所述三碱基基序中的尿苷正对的A，与所述靶腺苷正对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷正对的胞苷、鸟苷或尿苷；和/或(vii)所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA，任选地其中所述靶RNA是前信使RNA。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其还包括将ADAR3抑制剂和/或干扰素刺激物引入所述宿主细胞。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其包括引入多个dRNA或构建体，它们各自靶向不同的靶RNA。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中编辑所述靶RNA的效率为至少40％。20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中所述构建体或所述dRNA不诱导免疫应答。21.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文胜，伊宗裔，璩良，田峰，王春慧，朱诗优，周卓，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：