一种具有高热稳定性的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高热稳定性的7α

【技术实现步骤摘要】
一种具有高热稳定性的7
α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物酶
，具体涉及一种具有高热稳定性的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]名贵中药熊胆可用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有明显的疗效。熊去氧胆酸(UDCA)和牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是其主要有效成分，UDCA和TUDCA的制备方法通常有熊胆提取法、化学合成法和生物转化法，其中是生物转化法由于具有成本低、工艺简单、绿色环保及反应温和等优点而日益受到重视。
[0003]生物转化法主要是利用7α
‑
羟基类固醇脱氢酶(7α
‑
hydroxysteroid dehydrogenase，7α
‑
HSDH)催化鹅去氧胆酸(CDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)7位上的羟基脱氢变成酮基，从而转化为7
‑
酮石胆酸(7
‑
KLCA)和牛磺
‑7‑
酮石胆酸(T
‑7‑
KLCA)，然后7β
‑
羟基类固醇脱氢酶(7β
‑
hydroxysteroid dehydrogenase，7β
‑
HSDH)催化7
‑
酮石胆酸(7
‑
KLCA)和牛磺
‑7‑
酮石胆酸(T
‑7‑
KLCA)7位上的酮基加氢变成羟基，从而转化为UDCA和TUDCA。但是，生物转化法受限于酶的性质，如野生型7α
‑
HSDH的来源十分广泛，目前国内外科研工作者已经筛选出众多产7α
‑
HSDH的微生物并将其编码基因克隆出来，它们分别来自于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、梭状芽胞杆菌(Clostridium scindens)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)和大肠埃希菌(Escherichia coli)等，但是这些野生型菌株普遍存在活性偏低、热稳定性差等缺点。为了解决这一问题，国内外科研工作者采用基因工程手段对酶进行突变改造来提升酶的活性和稳定性，但是所获得的突变酶的活力以及热稳定性欠佳，使其难以适用于工业大规模化生产中。
[0004]因此，开发一种新的适用于工业大规模生产、热稳定性高的7α
‑
HSDH突变体并运用其进行双酶一步转化具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，以解决现有野生型7α
‑
HSDH和突变酶存在酶活力低、热稳定性欠佳且难以应用到工业大规模化生产中的问题。
[0006]为解决上述问题，本专利技术第一方面，提供了一种具有高热稳定性的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α
‑
HSDH(源自撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)，uniprot:G9FRD7)的第108位天冬氨酸替换为异亮氨酸得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007]本专利技术第二方面，提供了一种具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体基因编码上述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体。
[0008]根据大肠杆菌的密码子偏好性对上述氨基酸序列的编码基因进行优化，获得适合大肠杆菌表达的DNA序列，优选地，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0009]本专利技术第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因。所述重组表达载体为质粒，质粒优选为pET28a。
[0010]本专利技术第四方面，提供了一种重组表达细胞，所述重组表达细胞含有上述重组表达载体。优选地，所述重组表达细胞为大肠杆菌。
[0011]本专利技术第五方面，提供了一种催化剂，所述催化剂的有效成分包含上述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体。
[0012]本专利技术第六方面，提供了上述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体或催化剂在催化鹅去氧胆酸制备7
‑
酮石胆酸中的应用。
[0013]本专利技术第七方面，提供了上述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体或催化剂在催化牛磺鹅去氧胆酸制备牛磺
‑7‑
酮石胆酸中的应用。
[0014]本专利技术第八方面，提供了制备上述具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，具体包括以下步骤：
[0015]S1、构建7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株，所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株含有上述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因；
[0016]S2、将所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体。
[0017]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0018]本专利技术通过结构对比野生型撒丁岛梭菌7α
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羟基类固醇脱氢酶与同源酶蛋白的异同，确定了影响酶学性质的位点为野生型7α
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HSDH的第108位氨基酸
‑‑
天冬氨酸，通过突变天冬氨酸变成非极性更强的异亮氨酸，改变了分子表面的疏水性，在不影响酶活性的前提下使7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体的热稳定性得到了提升，延长酶在温度较高的反应体系中的活性时间，避免了酶在温度高时活性高维持时间短、温度低时活性低但维持时间长的尴尬局面，可以有效解决工业生产控制低温需要消耗较多能源且很难实现的问题，适用于工业大规模生产中。
附图说明
[0019]图1为本专利技术的NADPH标准曲线图；
[0020]图2为本专利技术实施例3所制得的具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体的SDS
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PAGE电泳图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。
[0022]一种具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体的方法，主要是对7α
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羟基类固醇脱氢酶的基因密码子进行优化和定点突变，构建表达7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体的表达载体；将表达载体转入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α
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HSDH的第108位天冬氨酸替换为异亮氨酸得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因编码如权利要求1所述的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体。3.根据权利要求2所述的具有高热稳定性的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有如权利要求2或3所述的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体基因。5.一种重组表达细胞，其特征在于：所述重组表达细胞含有如权利要求4所述的重组表达载体。6.一种催化剂，其特征在于：所述催化剂的有效成分包含如权利要求1所述的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体。7.如权利要求1所述的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求6所述的催化剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋建芳，
申请(专利权)人：宋建芳，
类型：发明
国别省市：