一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法，通过原始菌种大肠杆菌二级培养发酵，并结合异丙基

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法


[0001]本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸(UDCA)是一种利胆药物，能够增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂的化合物，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，临床常用于胆结石的防治、胆囊炎等疾病的治疗。
[0003]鹅去氧胆酸氧化物(7
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酮石胆酸，7K
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LCA)是酶法生产UDCA的重要生产原料。然而，常用的化学法生产7K
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LCA的过程需使用大量有机溶剂，存在环境污染和爆炸风险，且反应过程会出现双氧化等杂质，不易去除，甚至会残留到后续的UDCA原料药中，为生产带来负担。
[0004]酶法制备7K
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LCA相比于化学方法具有突出的优势，鹅去氧胆酸在鹅去氧胆酸氧化酶的作用下，能够发挥酶自身能与底物高效结合的优势，发生氧化反应将原料鹅去氧胆酸直接催化，脱去7
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位羟基可经氧化为酮基，生成7K
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LCA。鹅去氧胆酸氧化酶主要成分为：7α
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羟基类固醇脱氢酶(以下简称7位氧化酶)和维生素B2还原酶(以下简称B2还原酶)及少量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称NAD))，
[0005]反应具体如下：
[0006][0007]鹅去氧胆酸氧化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性，研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株，或者构建基因工程菌株。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道，主要是因为鹅去氧胆酸氧化酶的发酵过程非常复杂，涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、诱导时机、溶氧等诸多条件相互配合，优化出恰当的发酵方法较非常困难。
[0008]因此，提供一种能够通过常见菌株发酵制备鹅去氧胆酸氧化酶的方法，可以大大降低基因工程改造的成本，有利于工业生产应用。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法。
[0010]本专利技术提供了一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法，包括如下步骤：
[0011](1)制备种子：将重组大肠杆菌接种至摇瓶培养基培养，得到摇瓶种子液；所述重
组大肠杆菌为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的大肠杆菌；所述表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012](2)种子罐发酵：将步骤(1)制得的摇瓶种子液接种至种子罐培养得一级种子液；培养温度：33℃～38℃，溶氧量：15％～35％；
[0013](3)发酵罐发酵：取步骤(2)培养的一级种子液接种至发酵培养基培养，培养温度：25℃～30℃，溶氧量：15％～35％，期间使用IPTG诱导。
[0014]进一步地，步骤(1)所述摇瓶培养基含有：蛋白胨0.5％～1.5％、酵母粉0.5％～0.8％、氯化钠0.5％～1.5％；
[0015]步骤(2)所述发酵培养基含有有：蛋白胨1.5～2.5％、酵母浸膏0.5％～1.0％、氯化钠0.3％～0.5％、七水硫酸镁0.15％～0.30％、磷酸二氢钾1.0％～2.0％、葡萄糖1.0％～2.0％、消泡剂0.02％～0.06％；
[0016]步骤(3)所述发酵培养基含有：蛋白胨1.5％～2.5％、氯化钠0.4％～0.6％、磷酸氢二钾三水合物0.5％～1.0％、磷酸二氢钾1.5％～2.0％、七水硫酸镁0.01％～0.03％、甘油1.5％～2.0％、消泡剂0.02％～0.08％。
[0017]进一步地，步骤(1)所述摇瓶种子液的OD600值为2.0～3.0。
[0018]更进一步地，步骤(1)所述培养的条件是：转速180r/min～220r/min，于33℃～40℃在pH 6.80～7.20条件下培养6h
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15h。
[0019]进一步地，步骤(2)所述培养温度：33℃～36℃，溶氧量：20％～35％。
[0020]更进一步地，步骤(2)所述的接种量为1.00％～1.25％(v/v)，培养条件为：pH为6.80～7.20，搅拌转速150r/min～350r/min，培养周期：4h～8h。
[0021]进一步地，步骤(3)所述培养温度28℃～30℃，搅拌转速150r/min～350r/min，溶氧量20％～35％。
[0022]更进一步地，步骤(3)所述的接种量为1.5％～3.0％(v/v)，培养条件为：pH为6.80～7.20，搅拌转速150r/min～350r/min，发酵周期：16h～24h；所述IPTG的诱导工艺是：培养4h～6h且10≤OD600值≤15时一次性加入IPTG50ppm～100ppm。
[0023]本专利技术提供了一种鹅去氧胆酸氧酶，所述鹅去氧胆酸氧酶中7α
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羟基类固醇脱氢酶的酶活不低100u/ml，维生素B2还原酶的酶活不低于30u/ml。
[0024]进一步地，上述鹅去氧胆酸氧酶由上述的方法制备而成。
[0025]实验结果表明，本专利技术发酵方法能够以简单的生物发酵工艺制得酶活较高7位氧化酶和B2还原酶，发酵周期短，生产效率高，制备得到的鹅去氧胆酸氧化酶可进一步用于酶法转化生产7
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酮石胆酸生产，节能环保，大大降低生产成本，工业应用前景良好。
[0026]本专利技术所述OD
600
值是指在波长600nm下检测的光密度值；IPTG是指异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖吡喃糖苷。
[0027]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
具体实施方式
[0029]本专利技术使用的生产菌种为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，外源基因序列如SEQ ID NO.1所示；具体是将SEQ ID NO.1所示的外源基因序列插入PET
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28A(+)大肠杆菌蛋白表达载体，将该含有外源基因的载体导入宿主菌株BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株所得。
[0030]除另有说明外，本专利技术所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0031]实施例1、本专利技术方法制备鹅去氧胆酸氧化酶
[0032](1)制备摇瓶种子液
[0033]摇瓶培养基含有：蛋白胨：0.5％～1.5％，酵母粉：0.1％～0.8％；氯化钠：0.5％～1.5％。
[0034]生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在pH6.80
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7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备种子：将重组大肠杆菌接种至摇瓶培养基培养，得到摇瓶种子液；所述重组大肠杆菌为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的大肠杆菌；所述表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)种子罐发酵：将步骤(1)制得的摇瓶种子液接种至种子罐培养得一级种子液；培养温度：33℃～38℃，溶氧量：15％～35％；(3)发酵罐发酵：取步骤(2)培养的一级种子液接种至发酵培养基培养，培养温度：25℃～30℃，溶氧量：15％～35％，期间使用IPTG诱导。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述摇瓶培养基含有：蛋白胨0.5％～1.5％、酵母粉0.5％～0.8％、氯化钠0.5％～1.5％；步骤(2)所述发酵培养基含有有：蛋白胨1.5～2.5％、酵母浸膏0.5％～1.0％、氯化钠0.3％～0.5％、七水硫酸镁0.15％～0.30％、磷酸二氢钾1.0％～2.0％、葡萄糖1.0％～2.0％、消泡剂0.02％～0.06％；步骤(3)所述发酵培养基含有：蛋白胨1.5％～2.5％、氯化钠0.4％～0.6％、磷酸氢二钾三水合物0.5％～1.0％、磷酸二氢钾1.5％～2.0％、七水硫酸镁0.01％～0.03％、甘油1.5％～2.0％、消泡剂0.02％～0.08％。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述摇瓶种子液的OD600值为2.0～3.0。4.如权利要求1或3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马利萍，邓旭衡，胡晓非，张云辉，李琨，韩原亮，何锡林，秦卫宁，
申请(专利权)人：伊犁川宁生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：