微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法技术方案

本发明专利技术公开了微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法，该微流控芯片由键合在一起的基片与盖片组成，盖片上设有混合微通道和反应微通道，混合微通道和所述反应微通道相互连接，反应微通道内具有微柱阵列，进一步地，微柱上修饰有发夹状寡核苷酸1。本发明专利技术检测方法是通过致病性细菌竞争结合引发两条发夹状寡核苷酸(H1,H2)发生催化发夹自组装反应，该反应不仅对致病性细菌的浓度进行放大，还将辣根过氧化物酶固定在微柱阵列上，进而催化鲁米诺和过氧化氢发生化学发光反应，通过化学反应信号强度来对致病性细菌进行定量。本发明专利技术具有良好的特异性，低的检测限和宽的线性范围，为定量检测食源性致病菌提供了较为准确的数据。数据。数据。

【技术实现步骤摘要】
微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法


[0001]本专利技术属于微流控芯片
，具体涉及微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法，特别是涉及一种用于致病性细菌的微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及致病性细菌的检测方法。

技术介绍

[0002]食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，可导致畜禽传染病或人肠道传染病及食物中毒，是食品安全问题的根源之一。常见食源性致病菌主要有致病性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等。大肠埃希氏菌O157：H7(E.coil O157:H7)是主要的食源性致病细菌之一，它是肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的代表菌株，感染剂量极低，潜伏期为3
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10天，病程2
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9天，可导致出血性结肠炎(HC)，通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，部分患者可发展为溶血性尿毒综合症(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等，严重者可导致死亡。食源性致病菌引发的食物中毒给公共卫生带来了沉重负担，也给人们的生命健康带来了严重威胁。因此，食品中致病菌的限量将有助于预防和控制此类事件的发生与传播。根据《食品安全国家标准食品中致病菌限量》规定，除金黄葡萄球菌的可接受水平的限量值为100CFU/g(mL)外，大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的可接受水平的限量值为0。食源性致病菌的限量必须依靠准确和快速的检测方法，所以，采用有效方法检测食源性致病菌至关重要。
[0003]目前，检测食源性致病菌的方法可分为间接法和直接法。间接法主要是对食源性致病菌的分泌物如内外毒素以及核酸进行检测，间接获得致病菌是否存在，往往需要复杂的样品前处理。直接法则是直接对样本中食源性致病菌的数量或浓度进行定量检测，包括平板计数法和生物传感器法。其中，平板计数法是食源性致病菌检测的金标准，拥有高的准确性和可靠性，但是需要专业的技术人员对样品进行长时间的培养和预富集，且检测时间长达2
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3天，耗费大量时间和人力物力。
[0004]微流控芯片技术是一种将生物或者化学实验(如样品的反应制备、分析提纯，检测分析等)微型化并集成到具有微米甚至纳米尺度微通道的芯片上，通过对流体进行精确控制完成复杂的分析流程。由于微流控芯片技术具有样品和试剂消耗量小，多样本可并行检测，高通量，分析速度快，以及易于集成化和自动化等优点，使其被广泛应用到分析检测领域。越来越多的研究开发了基于微流控芯的食源性致病菌检测方法，例如比色法、荧光法、电化学法、表面拉曼散射法、表面等离子体共振法以及侧向流动条等方法。这些方法各自存在一定的不足，其中比色法和荧光法灵敏度不高，电化学法重现性较差，表面拉曼散射法、表面等离子体共振法需要复杂且昂贵的信号检测仪器。因此需要开发一种检测灵敏度高，信号检测仪器简单廉价的食源性致病菌检测方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的不足，本专利技术基于催化发夹自组装和化学发光法，提出微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法。
[0006]化学发光法是一种将检测目标的浓度信号转换为化学发光强度的方法，主要的信号产生机制是基于通过酶催化底物和氧化剂(如鲁米诺
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过氧化氢体系)发生化学发光反应。化学发光法依靠痕量分析物的化学反应产生化学发光，因此灵敏度高。此外，不需要激发光源，从而避免了光散射的干扰，并且化学发光法的仪器和操作简单，校准范围宽，其小型化的适用性为食源性致病菌的检测提供了巨大的潜力。
[0007]催化发夹自组装(catalysed hairpin assembly,CHA)是一种优越的信号放大策略，其基本原理是由精心设计的两条发夹状寡核苷酸和一条链状寡核苷酸，利用茎环结构上“立足点”，能够被序列互补的裸露核酸通过碱基互补配对原则及拓扑反应动力学作用改变结构，从而完成寡核苷酸之间的自组装及去组装过程。该反应的净结果是产生两条发夹状寡核苷酸的杂交链，通过在发夹状寡核苷酸中引入特定基团，将杂交链固定在基底上和产生分析信号。由于链状寡核苷酸被多次重复使用，只要将链状寡核苷酸和目标分析物建立关联，就可以通过上述反应，将目标分析物的浓度信号进行放大。
[0008]本专利技术具体技术方案如下：
[0009]本专利技术第一方面提供一种微流控芯片，所述微流控芯片由键合在一起的基片与盖片组成，所述盖片上设有混合微通道和反应微通道，所述混合微通道和所述反应微通道相互连接，所述反应微通道内具有微柱阵列。
[0010]进一步地，所述混合微通道为蛇形混合微通道，所述反应微通道为船形反应微通道；
[0011]所述船形反应微通道包括两个船头和位于两个船头之间的船身，一个船头作为进口，另一个作为出口；
[0012]所述混合微通道包括进口和出口；
[0013]优选地，所述混合微通道包括2个进口；
[0014]优选地，所述混合微通道出口与所述船形反应微通道的船头进口相互连接；
[0015]优选地，所述反应微通道的长为16mm，宽为3mm，进口处渐扩和出口处渐缩的流线形设计，避免了死角的产生，使混合后的试剂进入船形通道后可以分布的更加均匀；
[0016]优选地，所述蛇形混合微通道的宽度为200μm，深度为150μm，长度为20cm，其狭窄延长的特点在流体力学上更大程度地让化学发光试剂充分混合，能够快速产生较高的化学发光信号，且将混合通道折叠成蛇形可以直到节省空间的作用。
[0017]优选地，所述微柱的直径为200μm，深度为150μm，微柱间距为200μm，提高船形反应微通道的内表面积，为其内表面修饰提供了更多的空间，在流体力学上能更大程度上增加催化发夹自组装反应的引发链与微柱的碰撞几率，增加引发链与发夹状寡核苷酸1的结合效率；
[0018]优选地，所述盖片的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其生物兼容性强，易于表面修饰，透光性好，适合化学发光检测。
[0019]进一步地，所述微柱上修饰有发夹状寡核苷酸1(H1)，所述发夹状寡核苷酸1用于发生催化发夹自组装反应；优选地，所述H1进行荧光标记来验证H1的成功修饰，正式实验使
用无荧光标记的H1。
[0020]优选地，微柱进行链霉亲和素修饰，发夹状寡核苷酸1通过生物素和链霉亲和素的结合修饰在微柱上。
[0021]本专利技术第二方面提供一种基于微流控芯片的检测系统，包括所述微流控芯片、进样单元和检测分析单元，所述进样单元与所述微流控芯片混合微通道的进口连通；
[0022]优选地，所述检测分析单元包括PMT探测器和超微弱化学发光分析仪，所述PMT探测器的进光口与反应微通道相匹配；
[0023]优选地，所述进样单元包括微量注射泵、导管和注射器，微流控芯片可以通过导管与注射器相连，通过微量注射泵精确的控制流量和流速，编程后自动化灌注化学发光试剂；
[0024本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由键合在一起的基片与盖片组成，所述盖片上设有混合微通道和反应微通道，所述混合微通道和所述反应微通道相互连接，所述反应微通道内具有微柱阵列。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述混合微通道为蛇形混合微通道，所述反应微通道为船形反应微通道；所述船形反应微通道包括两个船头和位于两个船头之间的船身，一个船头作为进口，另一个作为出口；所述混合微通道包括进口和出口；优选地，所述混合微通道包括2个进口；优选地，所述混合微通道出口与所述船形反应微通道的船头进口相互连接；优选地，所述反应微通道的长为16mm，宽为3mm；优选地，所述蛇形混合微通道的宽度为200μm，深度为150μm，长度为20cm；优选地，所述微柱的直径为200μm，深度为150μm，微柱间距为200μm；优选地，所述盖片的材料为聚二甲基硅氧烷。3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微柱上修饰有发夹状寡核苷酸1，所述发夹状寡核苷酸1用于发生催化发夹自组装反应；优选地，微柱进行链霉亲和素修饰，发夹状寡核苷酸1通过生物素和链霉亲和素的结合修饰在微柱上。4.一种基于微流控芯片的检测系统，其特征在于，包括权利要求1
‑
3任一项所述微流控芯片、进样单元和检测分析单元，所述进样单元与所述微流控芯片混合微通道的进口连通；优选地，所述检测分析单元包括PMT探测器和超微弱化学发光分析仪，所述PMT探测器的进光口与反应微通道相匹配；优选地，所述进样单元包括微量注射泵、导管和注射器；优选地，所述检测系统还包括与微流控芯片出口连通的废液池。5.一种基于微流控芯片的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项所述微流控芯片、致病性细菌的特异性核酸适配体与引发链形成的杂交链、发夹状寡核苷酸2与辣根过氧化物酶修饰的金纳米颗粒、鲁米诺以及过氧化氢；所述致病性细菌的特异性核酸适配体、引发链、发夹状寡核苷酸1和发夹状寡核苷酸2满足下述条件(1)或(2)；(1)所述致病性细菌的特异性核酸适配体具有m个碱基，所述致病性细菌的特异性核酸适配体3
’
端与引发链有n个互补配对碱基，其中n/m为1/4～1/3；所述引发链的5
’
端与发夹状寡核苷酸1的3
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端6～10个裸露的碱基互配对；所述发夹状寡核苷酸1的5
’
端与发夹状寡核苷酸2的3
’
端6～10个裸露的碱基互补配对；优选地，所述发夹状寡核苷酸1的5
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端用生物素修饰；所述发夹状寡核苷酸2的5
’
端用巯基标记，辣根过氧化物酶上有氨基酸残基巯基，所述发夹状寡核苷酸2和辣根过氧化物酶通过金硫键修饰到金纳米颗上，形成发夹状寡核苷酸2与辣根过氧化物酶修饰的金纳米颗粒；(2)所述致病性细菌的特异性核酸适配体具有m个碱基，所述致病性细菌的特异性核酸
适配体5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇扬，高丹，孙冬丽，樊婷婷，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：