基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于杆菌肽与百里酚酞共组装的pH响应变色纳米颗粒的制备方法，以及将该纳米颗粒用于可视化检测大肠杆菌的方法。制备时，将杆菌肽与百里酚酞共组装，利用溶液的极性变化使百里酚酞和杆菌肽共组装形成纳米颗粒；然后利用纳米颗粒与适配体修饰的磁珠以及细菌构筑夹心结构，最后通过加入NaOH溶液刺激百里酚酞显色，通过酶标仪检测ΔOD值或智能手机检测

【技术实现步骤摘要】
基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒及其应用


[0001]本专利技术涉及纳米材料及其应用，具体是一种基于杆菌肽（一种表观浅黄色的抗菌肽，AMP）与百里酚酞（Thymolphthalein，TP）组装pH响应变色纳米颗粒（Nanoparticles，NPs）及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）又叫大肠埃希氏菌，是一种条件致病性的人畜共患病病原菌，对人和动物健康有着严重的危害。因致病性E. coli造成的动物感染和动物产品污染在动物健康和公共卫生安全上是一个严重的问题。E. coli的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。因此，E. coli的精准检测显得尤为关键，对于环境科学和生命医学领域具有重要意义。
[0003]AMP是一种由非核糖体肽合成酶合成的广谱多肽类抗生素，是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵生产的次级代谢产物。AMP对革兰氏阳性细菌和大多数革兰氏阴性细菌都有强的杀菌作用。AMP在酸性和中性水溶液中都能稳定存在，但在碱性环境pH>8.0的室温条件下迅速降解。在pH值或温度的刺激下，抗菌肽可通过非共价键、疏水作用和非特异性范德华作用等作用力自发的分子排列形成特定形状的纳米自组装结构，从而提高抗菌肽在体内的稳定性和增加细菌捕获位点，提高生物相容性。因此AMP在检测大肠杆菌领域具有较好的前景。
[0004]细菌检测常用细菌细胞培养技术，但该方法比较耗时费力。随后开发了石英晶体微量天平、表面等离子体共振、表面增强拉曼散射、荧光光谱、电化学传感器、聚合酶链反应、DNA微阵列分析、微流控分析装置和流式细胞术等检测方法。上述方法虽然比传统的细菌培养技术省时，但需要专业人员操作特定的化学仪器且操作复杂，不利于应用推广。为了能够有效的预防细菌感染，开发即时检测新方法对食品检测、环境检测及临床诊断均具有重要意义。
[0005]目前，常使用抗体、适配体和噬菌体作为分子识别试剂去设计病原菌免疫生物传感检测方法。但是利用这些识别元件设计检测细菌的传感器需要用到信号放大技术以提高灵敏度，比如酶标记或荧光分子标记。但是这些标记过程容易导致抗体或酶失活，导致假阴性信号，同时也面临着抗体和噬菌体作为分子识别元素时的高成本问题。
[0006]在已经公开的检测大肠杆菌E. coli的相关专利中CN113152091A 一种可视检测大肠杆菌和pH响应的多糖基水凝胶基织物及其制备方法。通过制备一种改性壳聚糖通过酰胺反应成为一种接枝发色/荧光化合物，该荧光化合物被E. coli分泌的细菌酶切割，最快30分钟内释放出发色或荧光基团，发色在自然光下可见。通过荧光强度、溶液颜色与E. coli浓度的线性关系，实现对E. coli的定量监测。然而该方法材料合成较为繁琐，检测方法较为复杂，检测范围较小，检测限不高。
[0007]CN113201585A 一种基于荧光聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)
技术定量检测E. coli的方法。通过将基因组DNA放入PCR反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行PCR扩增和熔解曲线测定，获得E. coli实时定量PCR的Ct值，根据标准对照液的Ct值和拷贝数拟合的线性关系，实现对E. coli的定量监测。但是该方法材料合成较为繁琐，检测方法较为复杂。并且标记过程容易导致抗体或酶失活，导致假阴性信号，所需检测药品昂贵并且该专利技术需要在无菌环境下进行，对检测环境要求较高。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对现有技术的不足，提出了一种基于AMP与TP共组装的pH响应变色纳米颗粒，以及该纳米颗粒用于可视化检测大肠杆菌（E. coli）的方法。本专利技术制备的AMP/TP NPs具有免标记、靶向信号放大一体化和抑制细菌生长的优点。可以将比色信号与智能手机结合有利于现场即时检测。
[0009]实现本专利技术目的的技术方案是：一种基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：（1）称取BSA溶解在水中，并在低温条件下搅拌混合，得到BSA水溶液；（2）称取TP溶解在DMSO中，搅拌，混合均匀得到TP的DMSO混合溶液；（3）将步骤（2）配制的TP的DMSO混合溶液滴入步骤（1）中配制的BSA水溶液中搅拌；（4）称取AMP溶解于步骤（3）配制的混合溶液中，搅拌，产物用超纯水离心洗涤，并分散到超纯水中，即合成AMP/TP NPs材料，即为基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒。
[0010]制备方法步骤（1）中，BSA与水的质量比为1∶（1~1000000）；低温条件为
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20℃~10℃；步骤（2）中，TP与DMSO的质量比为1∶（1~100000）；步骤（3）中，BSA水溶液与TP的DMSO溶液体积比为1∶（1~1000）；步骤（4）中，AMP与步骤（3）中混合溶液体积比为1∶（1~10000000）。
[0011]本专利技术另一目的是将制备的pH响应变色纳米颗粒用于可视化检测大肠杆菌。
[0012]采用本专利技术制备方法，制备的pH响应变色纳米颗粒检测大肠杆菌的方法包括以下步骤：S1、合成适配体修饰磁珠Apt
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MBS1.1、适配体链Apt开盖前先离心，离心后加入水混匀，配置为适配体链溶液；S1.2、取超声后的链霉亲和素标记的四氧化三铁（Streptavidin
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Fe3O4）磁珠原液用PBS溶液磁分离洗涤，洗涤后加入水配置为Streptavidin
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Fe3O4磁珠水溶液；S1.3、向S1.2配制的Streptavidin
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Fe3O4磁珠水溶液中加入Bio
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Apt混匀，混匀后孵育；S1.4、将S1.3混合溶液磁分离除去过量的Bio
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Apt，并用pH 7.4的PBS溶液磁分离洗涤，洗涤后分散在PBS溶液中即得到适配体偶联的磁珠Apt
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MB；S2、检测大肠杆菌S2.1、将大肠杆菌溶液用PBS溶液离心洗涤，大肠杆菌沉淀在PBS溶液中分散得到大肠杆菌原液；
S2.2、取S2.1中大肠杆菌原液逐级稀释为不同浓度的大肠杆菌标准溶液；S2.3、取S2.2中不同浓度的大肠杆菌标准溶液与S1.4中Apt
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MB及AMP/TP NPs材料混匀，混匀后孵育；S2.4、磁分离S2.3的混合溶液，去除过量的AMP/TP NPs，磁分离后洗涤；S2.5、向S2.4洗涤后的混合溶液中，加入 PBS和 NaOH洗脱Apt
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MB，磁分离，同时观察AMP/TP NPs＠大肠杆菌溶液颜色，取上清液至96孔板测量OD值；若测定大肠杆菌实际样，则将S2.3中不同浓度的大肠杆菌标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）称取BSA溶解在水中，并在低温条件下搅拌混合，得到BSA水溶液；（2）称取TP溶解在DMSO中，搅拌，混合均匀得到TP的DMSO混合溶液；（3）将步骤（2）配制的TP的DMSO混合溶液滴入步骤（1）中配制的BSA水溶液中搅拌；（4）称取AMP溶解于步骤（3）配制的混合溶液中，搅拌，产物用超纯水离心洗涤，并分散到超纯水中，即合成AMP/TP NPs材料，即为基于杆菌肽与百里酚酞的pH响应变色纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的pH响应变色纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，BSA与水的质量比为1∶（1~1000000）；低温条件为
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20℃~10℃；步骤（2）中，TP与DMSO的质量比为1∶（1~100000）；步骤（3）中，BSA水溶液与TP的DMSO溶液体积比为1∶（1~1000）；步骤（4）中，AMP与步骤（3）中混合溶液体积比为1∶（1~10000000）。3.权利要求1
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2任一项所述的制备方法制得的AMP/TP NPs材料。4.权利要求3所述的AMP/TP NPs材料在检测大肠杆菌中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测大肠杆菌的方法包括以下步骤：S1、合成适配体修饰磁珠Apt
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MBS1.1、适配体链Apt开盖前先离心，离心后加入水混匀，配置为适配体链溶液；S1.2、取超声后的Streptavidin
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Fe3O4磁珠原液用PBS溶液磁分离洗涤，洗涤后加入水配置为Streptavidin
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Fe3O4磁珠水溶液；S1.3、向S1.2配制的Streptavidin
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Fe3O4磁珠水溶液中加入Bio
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Apt混匀，混匀后孵育；S1.4、将S1.3混合溶液磁分离除去过量的Bio
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Apt，并用pH 7.4的PBS溶液磁分离洗涤，洗涤后分散在PBS溶液中即得到适配体偶联的磁珠Apt
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MB；S2、检测大肠杆菌S2.1、将大肠杆菌溶液用PBS溶液离心洗涤，大肠杆菌沉淀在PBS溶液中分散得到大肠杆菌原液；S2.2、取S2.1中大肠杆菌原液逐级稀释为不同浓度的大肠杆菌标准溶液；S2.3、取S2.2中不同浓度的大肠杆菌标准溶液与S1.4中Apt
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MB及AMP/TP NPs材料混匀，混匀后孵育；S2.4、磁分离S2.3的混合溶液，去除过量的AMP/TP NPs，磁分离后洗涤；S2.5、向S2.4洗涤后的混合溶液中，加入 PBS和 NaOH洗脱Apt
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MB，磁分离，同时观察AMP/TP NPs＠大肠杆菌溶液颜色，取上清液至96孔板测量OD值；若测定大肠杆菌实际样，则将S2.3中不同浓度的大肠杆菌标准溶液替换为待测大肠杆菌的实际样；在590 nm处测定其OD值，在37 ℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：林天然，来去平，蒋高艳，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：