本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条及制备方法。试纸条包括PVC底板，在PVC底板上从左到右依次搭建样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。在检测线和质控线上预先固载荧光染料。所述金标结合垫上包被有胶体金标记的鼠抗人新型冠状病毒1号单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上包被有鼠抗人新型冠状病毒2号单克隆抗体作检测线，以及包被有新型冠状病毒重组抗原作为质控线。本发明专利技术背景荧光免疫层析试纸条采用夹心/竞争结合的模式检测新冠病毒N抗原，具有较好的灵敏性和特异性，并且回收率较高，为临床使用提供了极大便利。极大便利。极大便利。
【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条及制备方法
[0001]本专利技术涉及免疫层析
，具体涉及一种新型冠状病毒N抗 原背景荧光免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
[0002]新冠病毒由四种结构蛋白和单股正链RNA组成，分别为刺突蛋 白(Spike Protein)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein),包膜蛋白 (Envelope Protein)和膜蛋白(Membrane Protein)，它们在分子表征 和宿主细胞进入中发挥作用。其中核衣壳蛋白(N蛋白)与病毒基因 组RNA结合并形成螺旋核糖核衣壳，参与基因组保护、病毒RNA 复制、病毒体组装和免疫逃避，是抗原抗体检测的一种重要靶点蛋白。
[0003]新冠病毒由四种结构蛋白和单股正链RNA组成，分别为刺突蛋 白(Spike Protein)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein),包膜蛋白 (Envelope Protein)和膜蛋白(Membrane Protein)，它们在分子表征 和宿主细胞进入中发挥作用。其中核衣壳蛋白(N蛋白)与病毒基因 组RNA结合并形成螺旋核糖核衣壳，参与基因组保护、病毒RNA 复制、病毒体组装和免疫逃避，是抗原抗体检测的一种重要靶点蛋白。
[0004]目前使用免疫层析试纸条检测新冠病毒感染，通常是检测新型冠 状病毒抗体IgG/IgM抗体和总抗体的检测。而检测新型冠状病毒抗原 的试纸条却比较少。我国通常检测新型冠状病毒的方法式基于PCR 法的核酸检测。为此本专利技术提供了一种新型冠状病毒抗原检测的试纸 条，适用于新型冠状病毒感染的临床辅助诊断，具有快速、准确和灵 敏度高的特点。
技术实现思路
[0005]因此，本专利技术要解决的问题在于一种检测新型冠状病毒N抗原 的试纸条，适用于新型冠状病毒感染的临床辅助诊断，具有快速、准 确和灵敏度高的特点，可实现样品的现场检测并提供定量的检测结果。
[0006]本专利技术提供了一种新型冠状病毒N抗原背景荧光免疫层析试纸 条及制备方法，包括：
[0007]PVC底板以及底板上依次重叠搭接上有样品垫、金标结合垫、 硝酸纤维素膜、吸水垫。所述硝酸纤维素膜上设置有相间隔的检测线 和质控线，在这两条线上先固载背景荧光染料，再涂布上抗体。所述 检测线靠近所述金标结合垫，所述质控线靠近所述吸水垫。
[0008]所述背景荧光染料的固载液为由以下重量百分数的组分组成：
[0009][0010][0011]余量为0.01M、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
[0012]所述金标结合垫上包被胶体金标记鼠抗人新型冠状病毒单克隆 抗体1。
[0013]所述硝酸纤维素膜的检测线上包被鼠抗人新型冠状病毒单克隆 抗体2。
[0014]所述硝酸纤维素膜的质控线上包被新型冠状病毒N抗原。
[0015]所述的试纸条，检测线上新型冠状病毒单克隆抗体包被浓度 2mg/ml。
[0016]所述的试纸条，质控线上新型冠状病毒N抗原包被浓度为 0.5mg/ml。
[0017]所述的试纸条，结合垫上标记的新型冠状病毒单克隆抗体的浓度 为16.8ug/ml。
[0018]所述金标结合垫上的胶体金颗粒的粒径为20
‑
40nm。
[0019]所述检测线与质控线之间的距离为0.8
‑
1cm，检测线和质控线互 不受干扰。
[0020]所述样品垫与金标垫均为玻璃纤维素膜。
[0021]本专利技术中，所述背景荧光免疫层析试纸条采用双抗体夹心与竞争 相结合的模式，结合胶体金对荧光的猝灭作用。若样品为阳性，则样 品中的新型冠状病毒抗原与金标记的单抗结合，在毛细作用下往吸水 纸处层析，经过检测线时与固载的捕获单抗结合从而对上面的荧光产 生猝灭作用，余量未与样品抗原结合的金标抗体与质控线处的新型冠 状病毒抗原结合。而样品为阴性，则样品流动层析至检测线处金标抗 体不与捕获抗体结合，从而不会产生荧光猝灭，层析至指控线出则结 合的更多，猝灭作用更强。通过检测线与质控线的荧光强度比值实现 对新型冠状病毒抗原的定量检测。
[0022]本专利技术中，提供了一种检测新型冠状病毒N抗原的试纸条的制 备方法，包括以下步骤：
[0023]1)制备金标结合垫，在金标结合垫上包被胶体金标记的新型冠 状病毒单克隆抗体1。
[0024]2)制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上包被新型冠状病毒单 克隆抗体2作为检测线，包被新型冠状病毒抗原作为质控线。
[0025]3)在PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、金标结合垫、硝酸 纤维素膜和吸水滤纸即可。
[0026]本专利技术制备方法中，所述抗体抗原购自武汉菲鹏公司，没有特殊 规定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择和制备。
[0027]本专利技术制备方法中，所述抗体包被缓冲液0.01M,pH＝7.4D的PBS 缓冲溶液，抗原包被缓冲溶液为0.01M，pH＝8.0的Tris
‑
HCL缓冲溶 液。
[0028]本专利技术制备方法中，所述金标结合垫的制备，包括以下步骤：
[0029]1)取一支1.5mL离心管，加入1ml胶体金溶液，用碳酸钾溶液 调节溶液的pH后加入16.8uL的1mg/ml单克隆抗体1，置于4摄氏 度冰箱中结合半小时后取出，加入50uL10％BSA溶液封闭1小时候 后取出以12000r/min、4℃的条件下离心20min。
[0030]2)取出后用含1％BSA、5％蔗糖的0.01M,pH＝7.4的PBS复溶液 复溶。
[0031]3)将复溶液涂布在预处理过的结合垫上。
[0032]4)将该结合垫在37℃烘箱中烘干1小时后取出密封保存，即得 到金标结合垫。
[0033]本专利技术制备方法中，提供了一种用于定量检测新型冠状病毒的试 纸条，具体使用方法如下：
[0034]1)吸取70uL待测样品缓慢滴加在试纸条的样品垫上。
[0035]2)计时，15分钟左右取出，用自组装荧光仪读取结果。
[0036]本专利技术技术方案，具有以下优点：
[0037]1)本专利技术提供的一种新型冠状病毒N抗原背景荧光免疫层析试 纸条及制备方法，包括：PVC底板以及底板上依次重叠搭接上有样 品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫。所述硝酸纤维素膜上设 置有相间隔的检测线和质控线，所述检测线靠近金标结合垫，所述质 控线靠近吸水垫。所述金标结合垫包被有胶体金标记的新型冠状病毒 单克隆抗体1，所述检测线包被有新型冠状病毒单克隆抗体2，所述 质控线包被有新型冠状病毒抗原。通过对样品和结合垫预处理，使得 样品流通顺畅不阻滞，并防止非特异性吸附。通过在检测线和质控线 上预先固载荧光染料，从而避免直接用荧光染料标记抗体，使用常用 的胶体金标记抗体，操作简便，偶联容易，节省成本，不破坏抗体活 性。
附图说明
[0038]为了更清楚的说明本专利技术具体实施方式，下面将对具体实施方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述PVC底板上从左到右依次为样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述金标结合垫上包被有胶体金标记的鼠抗人新型冠状病毒1号单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上包被有鼠抗人新型冠状病毒2号单克隆抗体作检测线，以及包被有新型冠状病毒重组N抗原作为质控线(竞争线)；所述背景荧光染料的固载液为由以下重量百分数的组分组成：余量为0.01M、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述结合垫上的1mg/ml新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体1的量16.8uL，在结合垫上包被量为400uL：所述硝酸纤维素膜上包被有鼠抗人新型冠状病毒2号单克隆抗体浓度为2mg/ml，包被量为6uL；所述新型冠状病毒重组N抗原的浓度为0.5mg/ml，包被量为6uL。3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述结合垫通过结合垫预处理液处理；所述结合垫处理液包括以下原料：5％蔗糖，1％吐温
‑
20，1％BSA溶解于0.01M，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫通过样品垫预处理液处理：所述样品垫处理液包括以下原料：1％吐温
‑
20，1％BSA溶解于0.01M，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述胶体金粒径为20
‑
40nm。6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒N抗原的背景荧光免疫层析试纸条，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘宏程，吴杰，方萍，张连明，徐安安，杨广田，钟婷，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：
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