一种新型冠状病毒免疫分型检测方法技术

本发明专利技术公开的属于外周血免疫细胞特征图谱研究技术领域，具体为一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，包含了38种细胞膜表面抗体，4种细胞内抗体，1种细胞核标记物，细胞死活标记物，细胞染色缓冲溶液，细胞膜打孔剂，细胞核染色缓冲溶液，细胞固定液，磷酸盐缓冲溶液，淋巴细胞分离液，染色完成后通过质谱流式细胞仪进行检测并收集数据；数据分析通过细胞膜表面抗体将外周血免疫细胞分出CD45

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒免疫分型检测方法


[0001]本专利技术涉及外周血免疫细胞特征图谱研究
，具体为一种新型冠状病毒免疫分型检测方法。

技术介绍

[0002]中性粒细胞、浆细胞、T细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞中检测到新冠病毒的核酸序列，其表现出亚基因组转录特点，说明新冠病毒在这些免疫细胞中曾经发生过活跃的转录与复制，也就是说不能将免疫细胞排除在新冠病毒宿主细胞范围之外。
[0003]对新型冠状病毒肺炎患者的免疫细胞分析，检测外周血免疫细胞分型的变化可以对新型冠状病毒肺炎患者的免疫状态进行评估，帮助新冠肺炎药物和临床研究，现有的分离方法是将外周血免疫细胞用流式抗体标记，用传统流式进行分离，因传统流式存在检测通道受限和荧光基团发射光谱重叠等技术限制，大于12色的实验就很难进行，导致对外周血免疫细胞检测的覆盖度不够，不能精准反映新型冠状病毒肺炎对免疫细胞亚群特征性变化。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式，在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0005]鉴于现有新型冠状病毒免疫分型检测方法中存在的问题，提出了本专利技术。
[0006]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，本专利技术包含了38种细胞膜表面抗体，4种细胞内抗体，1种细胞核标记物，细胞死活标记物，细胞染色缓冲溶液，细胞膜打孔剂，细胞核染色缓冲溶液，细胞固定液，磷酸盐缓冲溶液，淋巴细胞分离液；
[0007]染色完成后通过质谱流式细胞仪进行检测并收集数据；
[0008]收集完成的数据经过tsne降维分析，此分析通过细胞膜表面抗体将外周血免疫细胞分出CD45
+
CD3
+
CD4
+
T细胞,CD45
+
CD3
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CD8
+
T细胞，CD45
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CD3
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CD4
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CD8
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T细胞，CD45
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CD3
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CD4
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CD8
‑
T细胞,CD45
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CD19
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B细胞，CD45
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CD3
‑
CD16
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NK细胞，CD45
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CD3
+
TCRgd
+
γδT细胞，CD45
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CD14
+
单核细胞，CD45
+
HLA
‑
DR
+
DC细胞，中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，通过Ki67、GranzymeB,检测各类型细胞增殖分化功能状态。
[0009]作为本专利技术所述的一种新型冠状病毒免疫分型检测方法的一种优选方案，其中：新型冠状病毒免疫分型检测方法，包括以下步骤：
[0010]S1.外周血单个核细胞分离；
[0011]S2.金属元素同位素标记抗体的制备；
[0012]S3.标记细胞；
[0013]S4.数据处理。
[0014]作为本专利技术所述的一种新型冠状病毒免疫分型检测方法的一种优选方案，其中：所述外周血单个核细胞分离，包括以下步骤：
[0015]S1.取新鲜抗凝全血5ml，用与全血等体积的磷酸盐缓冲溶液进行混匀稀释，所述新鲜抗凝全血为EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝；
[0016]S2.在15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液,将稀释后的血液沿管壁缓慢加入到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；
[0017]S3.室温，水平转子800g，离心25min，并打开离心机刹车；
[0018]S4.离心完成后离心管内将出现明显的分层显现，共4层:从管口至管底依次是稀释的血浆层，白膜层，分离液层，红细胞与粒细胞层；
[0019]S5.将白膜层细胞吸取到15mL离心管中，吸取完成后，用PBS将离心管补满混匀以洗涤白膜层细胞，300g，离心5min；
[0020]S6.弃上清，15mL的PBS重悬细胞沉淀，300g，离心5min，重复操作一次；
[0021]S7.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml磷酸盐缓冲溶液中备用，并取10μl细胞悬液与10μl0.4％台盼蓝溶液混匀计数。
[0022]作为本专利技术所述的一种新型冠状病毒免疫分型检测方法的一种优选方案，其中：除购置于富鲁达的金属预标记抗体外，还需通过Maxpar X8 Antibody Labeling Kit及Maxpar MCP9 Antibody Labeling Kit对未进行金属耦联的纯抗体进行标记，以完成后续检测操作。
[0023]作为本专利技术所述的一种新型冠状病毒免疫分型检测方法的一种优选方案，其中：所述标记细胞包括以下步骤：
[0024]S1.取3X106个细胞，用不含Ca
2+
Mg
2+
的PBS重悬，将体积调至1ml；
[0025]S2.转入流式管内，加入终浓度为0.5uM，如母液为5mM，1:10000稀释的顺铂，混匀后室温放置2min；
[0026]S3.加入2ml Cell Staining Buffer终止反应，常温300g离心5分钟，此时进行S5；
[0027]S4.弃上清；
[0028]S5.配置block mix，每个样本对应50μlμl/样本；
[0029]S6.每管样本加入50μl block mix，重悬细胞，室温放置10min，孵育结束后不必去除封闭液，直接加入antibody cocktail，在孵育时间内按步骤7进行antibody cocktail配置；
[0030]S7.配置膜蛋白antibody cocktail；
[0031]S8.向封闭结束后的每管样本中加入50μl antibody cocktail，加上之前的50μl封闭液，此时体积为100μl；
[0032]S9.轻柔吹打混匀细胞，室温放置15min；
[0033]S10.轻柔vortex混匀细胞，继续室温放置15min；
[0034]S11.每管样本中加入2ml Cell Staining Buffer，室温离心300gX5min，弃上清；
[0035]S12.重复步骤S11；
[0036]S13.轻柔vortex，在残留的上清中完全打散细胞，细胞核蛋白染色，重要：在加入Nuclear Antigen Staining Buffer之前需要充分打散细胞；
[0037]S14.配置Nuclear Antigen Staining Buffer；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，其特征在于：本发明包含了38种细胞膜表面抗体，4种细胞内抗体，1种细胞核标记物，细胞死活标记物，细胞染色缓冲溶液，细胞膜打孔剂，细胞核染色缓冲溶液，细胞固定液，磷酸盐缓冲溶液，淋巴细胞分离液；染色完成后通过质谱流式细胞仪进行检测并收集数据；收集完成的数据经过tsne降维分析，此分析通过细胞膜表面抗体将外周血免疫细胞分出CD45
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CD3
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CD4
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T细胞,CD45
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CD3
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CD8
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T细胞，CD45
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CD3
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CD4
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CD8
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T细胞，CD45
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T细胞,CD45
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B细胞，CD45
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NK细胞，CD45
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γδT细胞，CD45
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CD14
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单核细胞，CD45
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HLA
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DR
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DC细胞，中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，通过Ki67、GranzymeB,检测各类型细胞增殖分化功能状态。2.根据权利要求1所述一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.外周血单个核细胞分离；S2.金属元素同位素标记抗体的制备；S3.标记细胞；S4.数据处理。3.根据权利要求2所述一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，其特征在于：所述外周血单个核细胞分离，包括以下步骤：S1.取新鲜抗凝全血5ml，用与全血等体积的磷酸盐缓冲溶液进行混匀稀释，所述新鲜抗凝全血为EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝；S2.在15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液,将稀释后的血液沿管壁缓慢加入到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；S3.室温，水平转子800g，离心25min，并打开离心机刹车；S4.离心完成后离心管内将出现明显的分层显现，共4层:从管口至管底依次是稀释的血浆层，白膜层，分离液层，红细胞与粒细胞层；S5.将白膜层细胞吸取到15mL离心管中，吸取完成后，用PBS将离心管补满混匀以洗涤白膜层细胞，300g，离心5min；S6.弃上清，15mL的PBS重悬细胞沉淀，300g，离心5min，重复操作一次；S7.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml磷酸盐缓冲溶液中备用，并取10μl细胞悬液与10μl0.4％台盼蓝溶液混匀计数。4.根据权利要求2所述一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，其特征在于：所述金属元素同位素标记抗体的制备，除购置于富鲁达的金属预标记抗体外，使MaxparX8 Antibody Labeling Kit及MaxparMCP9 Antibody Labeling Kit对未进行金属耦联的纯抗体进行标记，以完成后续检测操作。5.根据权利要求2所述一种新型冠状病毒免疫分型检测方法，其特征在于：所述标记细胞包括以下步骤：S1.取3X106个细胞，用不含Ca
2+
Mg
2+
的PBS重悬，将体积调至1ml；S2.转入流式管内，加入终浓度为0.5μM，如母液为5mM，1:10000稀释的顺铂，混匀后室温放置2min；S3.加入2ml Ce...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兵，张俊，
申请(专利权)人：南京傲因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：