一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用，属于食用菌分子生物技术和基因工程领域；本发明专利技术中从灰树花(Grifola frondosa)中克隆得到了UDP葡萄糖基转移酶UGT88A1，并将其命名为GFUGT88A1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述UDP葡萄糖基转移酶为尿苷二磷酸葡萄糖(UDP

【技术实现步骤摘要】
一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于食用菌分子生物技术和基因工程领域，具体涉及一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]多糖结构复杂，其由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖等各种单糖通过立体和区域糖苷键连接而成，是植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中提供能量、支撑细胞结构和发挥生物学功能的重要成分。目前虽然通过完全酸水解、甲基化分析结合核磁共振(NMR)光谱和原子力显微镜(AFM)等化学方法阐明了植物和微生物多糖的精细结构。然而，UDP
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葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)、UDP
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糖基转移酶(UGT)和葡聚糖合酶(GLS)等多糖合成相关酶的合成途径和催化特性仍需继续深入研究。
[0003]UGT属于糖基转移酶家族(GTs；EC 2.4.xy)，它将糖部分从活化的核苷酸糖供体(UDP
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葡萄糖[UDP
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glu]、UDP
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半乳糖和UDP
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木糖)转移到各种受体分子，例如核苷酸、糖类、脂质、蛋白质、抗生素和小分子/特殊代谢物。UGT已被证明在植物天然产物的糖基化中发挥不可或缺的作用，以调节植物生长和发育，包括激素稳态和授粉，以及环境相互作用，包括外源性解毒和对紫外线辐射的耐受性。最近，使用UGT作为生物催化剂来合成高价值的糖苷已经引起了人们的关注。
[0004]糖基转移酶(GTs；EC2.4.xy)属于转移酶家族，它将糖部分从活化的核苷酸糖(如UDP
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葡萄糖、UDP
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半乳糖和UDP
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木糖)供体转移到糖类或非糖类受体以合成寡糖、多糖、糖缀合物、抗生素和小分子。根据序列同一性、保守基序和糖苷键的立体化学，糖基转移酶分为114个家族。尿苷二磷酸(UDP)
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糖基转移酶(UGTs)属于家族1，其广泛存在于植物、动物、真菌、细菌以及病毒中。
[0005]灰树花是一种担子菌属真菌，富含碳水化合物(～50％，干基)、蛋白质(～20％)以及脂质(～5％)。目前灰树花多糖结构已被很好地表征，并被证明具有多种功能，包括抗肿瘤、免疫刺激、抗糖尿病和降血糖活性。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在不足，本专利技术提供了一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶及其编码基因和应用。本专利技术中从灰树花(Grifola frondosa)中克隆得到了UDP葡萄糖基转移酶UGT88A1，并将其命名为GFUGT88A1；所述灰树花UDP葡萄糖基转移酶能够用于体外催化合成低聚糖。
[0007]本专利技术中首先提供了一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶，将其命名为GFUGT88A1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述UDP葡萄糖基转移酶为尿苷二磷酸葡萄糖(UDP
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葡萄糖)依赖的葡萄糖基转移酶。
[0008]编码上述灰树花UDP葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码序列全长为1386个核苷酸。
[0009]本专利技术中还提供了一种重组表达载体，所述重组载体含有上述灰树花UDP葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，所述重组表达载体为适用于在大肠杆菌中表达的载体。
[0010]本专利技术中还提供了含有上述重组表达载体的转基因工程菌，所述转基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0011]本专利技术中还提供了上述灰树花UDP葡萄糖基转移酶的克隆表达方法，包括如下步骤：
[0012]将编码UDP葡萄糖基转移酶的核苷酸序列克隆入表达载体，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)中；最后经纯化得到UDP葡萄糖基转移酶。
[0013]本专利技术中还提供了上述UDP葡萄糖基转移酶体外催化合成低聚糖的应用，所述应用为通过所述的UDP葡萄糖基转移酶，将糖基供体UDP
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葡萄糖中的糖基转移并结合到昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖的受体寡糖上，合成更高聚合度的低聚糖。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0015]本专利技术首次异源表达灰树花多糖合成相关UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1，并发现UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1能够体外催化合成聚合度更高寡糖链的功能，填补了现有技术中UDP葡萄糖基转移酶作用于高等真菌多糖合成过程的技术空白，具有十分重要的意义。
[0016]本专利技术中，克隆表达纯化得到的UDP
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葡萄糖基转移酶GFUGT88A1能够以UDP
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葡萄糖作为供体，以不同聚合度的寡糖作为受体，催化合成聚合度更高的寡糖链。本专利技术对UDP
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葡萄糖基转移酶催化多糖合成具有重要的学术价值。
附图说明
[0017]图1为pET
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30a(+)
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gfugt88A1表达质粒图谱。
[0018]图2为琼脂糖凝胶电泳图，图中，M：DNA Maker；Lane1：pET
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30a(+)
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gfugt88A1；Lane2：pET
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30a(+)
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gfugt88A1经NdeI和HindIII双酶切验证。
[0019]图3为将重组表达载体pET
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30a(+)
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gfugt88A1转化到大肠杆菌BL21(DE3)后的菌落PCR验证。M：DNA Maker；Lane1：转化失败；Lane2
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5：转化成功。
[0020]图4为GFUGT88A1重组蛋白的异源表达验证图；其中A为SDS
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PAGE蛋白电泳图；B为Western
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blot图。
[0021]图5为AKTA纯化GFUGT88A1重组蛋白的吸收峰图及收集的目的蛋白SDS
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PAGE电泳图；图中，峰I代表杂蛋白，峰II代表咪唑洗脱的目的蛋白GFUGT88A1。
[0022]图6为UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1以UDP
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葡萄糖作为供体、昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖分别作为受体进行的酶学性质测定结果图，其中A为酶动力学参数测定图；B为金属离子对GFUGT88A1酶活性影响图；C为GFUGT88A1最适温度的测定图；D
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F分别为以昆布二糖、昆布六糖和昆布九糖作为受体进行的GFUGT88A1热稳定性的测定图；G为GFUGT88A1最适pH的测定；H为GFUGT88A1的pH稳定性测定图。
[0023]图7为UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1以UDP
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葡萄糖作供体对不同聚合度寡糖作为受体底物进行体外合成产物的HPLC分析图谱；其中A为以昆布二糖(LAM2)为底物、B为以昆布六糖(LAM6)为底物、C为以昆布九糖(LAM9)为底物，图中自下而上分别对应反应时间0h，12h，24h本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种灰树花UDP葡萄糖基转移酶，所述灰树花UDP葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的灰树花UDP葡萄糖基转移酶，其特征在于，所述UDP葡萄糖基转移酶为尿苷二磷酸葡萄糖UDP
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葡萄糖依赖的葡萄糖基转移酶。3.编码权利要求1所述的灰树花UDP葡萄糖基转移酶的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种重组表达载体，所述重组表达载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为适用于在大肠杆菌中表达的载体。6.一种转基因工程菌，所述转基因工程菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔凤杰，梁英英，付鑫，孙雷，孙文敬，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：