一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用制造技术

本发明专利技术涉及原生质体制备技术领域，具体涉及一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，所述缓冲稳定剂含有终浓度为0.02～0.2mol/L的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/L的MgCl2。本发明专利技术在缓冲稳定剂中加入小分子氨基酸衍生物依克多因，能够保护细胞在高盐、高温等极端条件下免受伤害，具有稳定渗透压、保护酶、DNA、蛋白质和生物膜的作用；且所使用缓冲稳定剂适用于植物及微生物的原生质体制备过程，可减少制备过程中原生质体的损伤，达到收到更多完整的原生质体并延长原生质体存放时间，较长时间保持活性及不破裂的目的。的。

【技术实现步骤摘要】
一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用


[0001]本专利技术涉及原生质体制备
，具体涉及一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用。

技术介绍

[0002]原生质体是植物和部分微生物利用机械或者酶解的方式去除掉细胞壁得到的细胞组分。原生质体在植物和微生物中的应用非常广泛，对于分子和细胞生物学的理论和应用研究具有重要的意义。植物原生质体具有细胞全能性，有再分化、重新进入细胞周期、分化为组织或器官的潜能，在细胞瞬时转化、亚细胞定位、细胞融合和大分子复合物相互作用等方面具有重要的应用。微生物原生质体能够更容易被诱变，并且原生质体融合在优良菌株选育方面也发挥着重要的作用。
[0003]原生质体在制备过程中，因为要去除细胞壁，过程繁多，在这个过程中原生质体很容易破损而导致收集到完整的原生质体细胞很少，会影响着后续实验的进行和结果。在制备原生质体的过程中需要添加稳定剂来保持原生质体pH、细胞膜和大分子等物质的稳定。
[0004]目前在制备植物和微生物原生质体所使用的缓冲稳定剂有所不同。对于植物来说，主要的缓冲稳定剂为2
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吗啉乙磺酸(MES)、甘露醇等物质；而在微生物原生质体的制备过程中，渗透压稳定剂则主要为蔗糖、山梨醇、氯化钾和硫酸镁等物质。稳定剂的选用对于原生质体内环境的平衡具有重要作用，选用不当会造成游离的原生质体破裂，制备出来的原生质体数量较少，并且存放时间较短，对后期原生质体再生及转化有很大的影响。

技术实现思路

[0005]针对现阶段制备植物和微生物原生质体所使用的缓冲稳定剂有所不同，现有技术缺少能够同时应用于植物和微生物的原生质体制备过程的缓冲稳定剂的问题，本专利技术提供一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，在缓冲稳定剂中加入小分子氨基酸衍生物依克多因(CAS号：96702
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3)，能够保护细胞在高盐、高温等极端条件下免受伤害，具有稳定渗透压、保护酶、DNA、蛋白质和生物膜的作用；且所使用缓冲稳定剂适用于植物及微生物的原生质体制备过程，可减少制备过程中原生质体的损伤，达到收到更多完整的原生质体并延长原生质体存放时间，较长时间保持活性及不破裂的目的。
[0006]本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，所述缓冲稳定剂含有终浓度为0.02～0.2mol/L的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/L的MgCl2。
[0008]进一步的，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16～0.2mol/L。
[0009]进一步的，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16mol/L。
[0010]进一步的，所述缓冲稳定剂中，MgCl2的终浓度为0.1～0.14mmol/L。
[0011]进一步的，所述缓冲稳定剂中，MgCl2的终浓度为0.14mmol/L。
[0012]进一步的，所述缓冲稳定剂的制备方法为配制终浓度的依克多因溶液，向依克多
因溶液中加入MgCl2得到混合溶液，使混合溶液中MgCl2浓度达到MgCl2终浓度要求，对混合溶液过滤除菌，得到所述缓冲稳定剂。
[0013]进一步的，所述原生质体为植物和/或微生物的原生质体。
[0014]进一步的，所述原生质体为拟南芥原生质体。
[0015]进一步的，所述原生质体为出芽短梗霉原生质体。
[0016]本专利技术的有益效果在于，本专利技术使用的含有终浓度为0.02～0.2mol/L的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/L的MgCl2的缓冲稳定剂处理原生质体，从细胞壁酶解开始便为保护酶、细胞膜、胞内组分提供一个较为温和的缓冲稳定环境，使整个细胞处于一种保护和稳定的状态，在细胞壁消解过程中对细胞内环境的pH、原生质体组分都有保护和稳定作用，避免因为失去细胞壁而造成细胞损伤，保证了细胞的完整性和活性，能够非常有效地提升原生质体制备的数量和质量，长时间放置能够减少原生质体的破裂度和破裂数量，有利于后续实验的进行。
具体实施方式
[0017]为了使本
的人员更好地理解本专利技术中的技术方案，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1
[0019]使用超纯水分别配制终浓度为0.02mol/L、0.1mol/L、0.16mol/L、0.2mol/L的依克多因溶液，向各份依克多因溶液中加入分别MgCl2得到混合溶液，使各混合溶液中MgCl2终浓度达到0.14mmol/L，用0.2μm过滤器过滤除菌得到缓冲稳定剂A1～4。
[0020]实施例2
[0021]使用超纯水配制4份终浓度为0.16mol/L的依克多因溶液，向4份依克多因溶液中加入MgCl2得到混合溶液，使混合溶液中MgCl2终浓度分别达到0.1mmol/L、0.14mmol/L、0.16mmol/L、0.2mmol/L，用0.2μm过滤器过滤除菌得到缓冲稳定剂B1～4。
[0022]对照例1
[0023]使用超纯水配制0.01mol/L的MES
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KOH溶液，并调pH为5.8～6.0，得到缓冲稳定剂CK1。
[0024]对照例2
[0025]使用超纯水配制浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液，即为缓冲稳定剂CK2。
[0026]对照例3
[0027]用超纯水配制0.01mol/L的MES
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KOH溶液，并调pH为5.8～6.0，然后加入终浓度为0.8mol/L的甘露醇溶液，得到缓冲稳定剂CK3。
[0028]对照例4
[0029]以2mol/L山梨醇作为缓冲稳定剂CK4。
[0030]对照例5
[0031]以1mol/L蔗糖溶液作为缓冲稳定剂CK5。
[0032]实施例3拟南芥原生质体保护测试
[0033]①
向适量超纯水中加入200μL浓度为0.5mol/L的MES及20g/L的纤维素酶和2.5g/L的离析酶，完全溶解后55℃水浴加热15分钟，冷却至室温，然后向溶液中分别加入缓冲稳定剂A1～4、B1～4及CK1～3各10ml，每份酶解液用超纯水定容至20mL，然后用0.2μm过滤器过滤除菌待用。
[0034]②
从前期培养的3
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5片叶拟南芥幼苗中挑选幼嫩叶片，轻轻切成1～2mm长条，放入装有酶解液的培养皿中，然后抽真空2分钟，再把培养皿置于20～25℃的摇床(40rpm)中避光培养2～3小时。
[0035]③
将含有原生质体的酶解液轻轻过滤至50mL离心管中，60
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g离心5分钟收集原生质体(加速、减速均为0)，使用10mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，其特征在于，所述缓冲稳定剂含有终浓度为0.02～0.2mol/L的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/L的MgCl2。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16～0.2mol/L。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16mol/L。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲稳定剂中，MgCl2的终浓度为0.1～0.14mmol/L。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫，李海军，张英华，李珍爱，王超，胡红涛，马双双，郑德强，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：