一种无菌苗来源植物细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种无菌苗来源植物细胞的制备方法，包括以下步骤：A、将植物种子去除种壳后进行消毒处理，然后接种于培养基上进行无菌培养；B、将步骤A培养获得的根伸长受到抑制的植物无菌苗切取根尖，并去除根冠后接种于培养基中进行培养，即得无菌苗来源植物细胞。本发明专利技术方法采用无菌苗为原材料，避免了植物内生菌感染的问题；通过在无菌苗培育阶段，对根尖干细胞进行诱导培养，同时抑制根的分化，进而避免了渗透剂的处理。本发明专利技术制备的无菌苗来源植物细胞悬浮后多以单细胞或者2

【技术实现步骤摘要】
一种无菌苗来源植物细胞及其制备方法


[0001]本专利技术属于植物干细胞制备
，具体涉及一种无菌苗来源植物细胞及其制备方法，尤其涉及一种无菌苗来源人参干细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科(Araliaceae)人参族(PANACEAE)人参属(Panax)植物。目前，从人参中提取的化学成分有人参皂苷、蛋白质、挥发油、多胺、低分子肽等。其中，人参皂苷是人参根的主要活性成分，如Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、Ro等。人参的人工栽培一般采用种子进行繁殖，经历5
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6年的栽培过程，才能采收加工。同时，人参种子具有后熟特性，需要经历长时间的形态后熟和生理后熟后才能播种。并且，人参存在着严重的连作障碍，栽培过人参的土地无法继续栽培人参，需要经过30
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60年的生态修复才能继续耕种。因此，需要大量的人力物力成本。
[0003]植物干细胞(Plant Stem Cells)又称为分生组织(Cambial meristematic cells，CMCs)，是相对于植物体内已经分化的成熟组织而言的，是植物体内未分化的细胞。能持续或周期性地进行细胞分裂，具有高度的再生能力，是植物生命力的起源。
[0004]愈伤组织(callus)是指原植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的一种脱分化的薄壁组织块。愈伤组织细胞(dedifferentiated callus cells,DDCs)是脱分化后的离体植物细胞，经过细胞分裂，产生无组织构造、疏松的细胞团。
[0005]自20世纪60年代以来，开展了大量的有关人参愈伤组织和人参不定根、毛状根的研究。虽然愈伤组织的培养过程避免了人参栽培过程中的缺点，但在愈伤组织的形成需要经过细胞脱分化的过程，该过程中不可避免的会出现体细胞无性系变异，无法保证遗传稳定性。并且脱分化后的细胞中次生代谢产物含量非常低，有的几乎没有。例如，喜树碱在喜树脱分化细胞中几乎检测不到。因此，如何提高愈伤组织中次生代谢产物的含量已经是目前植物组织培养的研究热点。2010年，研究者Lee发表了红豆杉干细胞培养的研究成果，其成功诱导分离了红豆杉和人参形成层中未分化的细胞[Lee Eun
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Kyong,et al.Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products.Nature Biotechnology,2010,28(11):1213
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U111]。该研究为植物细胞培养提供了一个新的研究思路，即直接培养植物体中未分化的细胞，避开细胞脱分化的过程。同时，韩国云火公司也研发了从草本植物形成层分离未分化细胞的方法(参见专利文献CN101939414A)。而另一项最新公开的专利文献CN112813018A中记载了一种人参干细胞的培养方法，其通过先一步法培养人参不定根，再取人参不定根的根尖部分经过渗透剂处理后进行诱导培养和繁殖培养，从而获得人参干细胞。可见，到目前为止，现有技术中进行人参干细胞培养时，仍然存在两个问题：1)需要经历外植体消毒的步骤，这将存在极大的材料污染可能性。因为植物存在着内生菌，在健康植物中无法避免。植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。现有技术在对植物外植体消毒中无法完全消灭植物内生菌。2)需
要采用渗透剂对外植体进行处理，且处理时间很长(16
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24h)。
[0006]在植物中，未分化的细胞存在于植物的分生组织中，而植物的分生组织一般包括顶端分生组织和侧生分生组织。其中顶端分生组织包括茎尖分生组织和根尖分生组织，侧生分生组织包括维管形成层和木栓形成层。植物中，根一般分为主根、侧根和不定根三种，当种子萌发时，首先突破种皮向外生长，不断垂直向下生长的部分即是主根。当主根生长到一定长度后，它会产生一些分枝，这些分枝统称为侧根。不定根是植物生长过程中，从茎或叶上长出的根，它不来自主根、侧根。目前，维管形成层中分生组织的干细胞培养成功的有红豆杉、银杏、番茄、人参等，其中红豆杉、银杏和番茄为茎中维管形成层，人参为贮藏根中维管形成层。根尖分生组织中静止中心干细胞培养成功的有水稻和玉米。但都未采用无菌苗来源的分生组织进行培养。人参也未见主根尖分生组织培养成功的报道。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种无菌苗来源植物细胞的制备方法。从人参无菌苗根尖分生组织得到干细胞系，该方法不需要单独去分化步骤，不需要外植体消毒步骤，不需要渗透处理步骤。
[0008]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009]本专利技术提供了一种无菌苗来源植物细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0010]A、将植物种子去除种壳后进行消毒处理，然后接种于培养基上进行无菌培养；
[0011]B、将步骤A培养获得的根伸长受到抑制的植物无菌苗切取根尖，并去除根冠后接种于培养基中进行培养，即得无菌苗来源植物细胞。
[0012]优选地，所述方法制备得到的植物细胞为植物干细胞。
[0013]优选地，步骤A中，所述植物种子为人参种子、野山参种子、林下参种子、园参种子中的任意一种。
[0014]优选地，步骤A中，所述植物种子为后熟处理的植物种子。
[0015]本专利技术的步骤A中需将植物种子去除种壳，由此避免了种壳带来的发芽困难，同时也避免了种壳内的存在的内生菌对后续培养无菌苗造成污染的风险，还能使消毒剂更加深入的杀灭种子内存在的内生菌。
[0016]本专利技术的步骤A中采用无菌培养，培育出的是无菌植株，避免了后续长期培养由植物自身菌群带来的风险。而正是由于保证了无菌状态，所以才适合长期培养，并且不用担心污染的问题。
[0017]优选地，步骤A中，所述消毒处理的步骤具体包括：将去除种壳的植物种子用水冲洗2.5
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3.5h后用乙醇浸泡4
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6min，再无菌水冲洗后用次氯酸钠浸泡，然后无菌水冲洗即可。
[0018]优选地，所述用次氯酸钠浸泡具体为：先用质量浓度为7
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8％的次氯酸钠浸泡0.5
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1.5min，再用质量浓度为1
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2％的次氯酸钠浸泡13
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18min；若仅用低浓度的次氯酸钠浸泡，灭菌效果不好。仅用高浓度的次氯酸钠浸泡，则会导致种子死亡过多(种子发芽率低于5％)。若先用低浓度的次氯酸钠浸泡后用高浓度的次氯酸钠浸泡，会造成高浓度次氯酸钠残留，从而引起种子死亡过多(种子发芽率低于1％)。本专利技术在前期的实验中发现，只有先进行高浓度的次氯酸钠浸泡再用低浓度的次氯酸钠浸泡，且控制浸泡时间，由此既不会导致过多种子死亡，使种子发芽率达到了2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将植物种子去除种壳后进行消毒处理，然后接种于培养基上进行无菌培养；B、将步骤A培养获得的根伸长受到抑制的植物无菌苗切取根尖，并去除根冠后接种于培养基中进行培养，即得无菌苗来源植物细胞。2.根据权利要求1所述的无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述植物种子为人参种子、野山参种子、林下参种子、园参种子中的任意一种；所述植物种子为后熟处理的植物种子；所述消毒处理的步骤具体包括：将去除种壳的植物种子用水冲洗2.5
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3.5h后用乙醇浸泡4
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6min，再无菌水冲洗后用次氯酸钠浸泡，然后无菌水冲洗即可。3.根据权利要求2所述的无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，所述用次氯酸钠浸泡具体为：先用质量浓度为7
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8％的次氯酸钠浸泡0.5
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1.5min，再用质量浓度为1
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2％的次氯酸钠浸泡13
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18min；所述无菌水冲洗的次数各为3
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5次。4.根据权利要求1所述的无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述培养基为MS培养基，培养条件为：温度22～25℃，湿度30～50％rH，光照度60～80％，12～16h光培养/12～8h暗培养，培养15～40d；所述MS培养基中包含以下浓度的各组分：蔗糖10～30g/l、琼脂粉4～10g/l、L
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抗坏血酸50～100mg/l、柠檬酸100～150mg/l、IAA 0.5～10mg/l、IBA 0.5～10mg/l。5.根据权利要求1所述的无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述培养采用的培养基为第一B5培养基，培养条件为：培养温度22～30℃，黑暗培养，培养20～40d；所述第一B5培养基中包含以下浓度的各组分：蔗糖10～30g/l、琼脂粉4～10g/l、L
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抗坏血酸50～100mg/l、柠檬酸100～150mg/l、IAA 0.5～10mg/l、IBA 0.5～10mg/l。6.根据权利要求1所述的无菌苗来源植物细胞的制备方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：C、将步骤B获得的无菌苗来源植物细胞置于培养基中进行增殖培养，即得大量无菌苗来源植物细胞；D、将步骤C获得的大量无菌苗来源植物细胞置于固体
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液...

【专利技术属性】
技术研发人员：金司阳，刘青，卢伊娜，施雪梅，田军，
申请(专利权)人：上海珈凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：