一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R

【技术实现步骤摘要】
一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]单细胞转录组测序是当前生命科学研究领域的尖端技术手段，已在众多动物组织中得到了广泛应用。但因为细胞壁的存在，目前植物组织进行单细胞转录组测序必须先将植物细胞解离为原生质体，如《Arabidopsis mesophyll protoplasts:aversatile cell system for transient geneexpression analysis》一文，通过制备拟南芥叶片原生质体，开展植物单细胞转录组测序。
[0003]现有技术中对于模式植物拟南芥的原生质体酶解方法和相应的单细胞转录组测序研究比较多，虽然拟南芥和艾草同属于植物，其叶片组织在结构和功能上具有一定的相似性。然而，由于生存于不同的环境中，植物通常表现出截然不同的生长发育特性。艾草的生长环境与拟南芥相比非常不同，造成了艾草细胞与拟南芥细胞在生理生化、结构、功能等方面均具有非常大的差异，适用于拟南芥叶片酶解的步骤在艾草当中不能有效发挥功能，导致艾草叶片组织无法开展单细胞转录组测序研究，需要开发一种新的适用于单细胞转录组测序实验的酶解液和其操作流程。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种适用于艾草叶片组织单细胞转录组测序中的样本解离的方法，及相应的酶解液配方和操作步骤。
[0005]本专利技术提供了一种适用于酶解艾草叶片的酶解液，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液。
[0006]其中，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R
‑
10、0.4％(m/v)离析酶R
‑
10、0.1～1％(m/v) 果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM 2
‑
(N
‑
吗啉基)乙磺酸MES、 20mMKCl、10mM CaCl2、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中。
[0007]优选地，所述果胶酶的终浓度为1％(m/v)；
[0008]优选地，所述半纤维素酶的终浓度为3％(m/v)；
[0009]优选地，所述甘露醇的终浓度为0.55mol/L。
[0010]其中，所述YF溶液中含有20mM 2
‑
(N
‑
吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、 0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP
‑
40，溶于超纯水中。
[0011]优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP
‑
40的终浓度为3％。
[0012]本专利技术所述YF缓冲液可以在洗涤原生质体的过程中，维持原生质体活性，且通过两遍洗涤仍有90％得率；其次，所述YF缓冲液还可以保护胞质内RNA不被影响。
[0013]上述酶解液A和YF缓冲液中的组分分别购自纤维素酶R
‑
10(Solarbio：C8260
‑
10G)、离析酶R
‑
10(Solarbio：M8190
‑
1G)、果胶酶(Solarbio：P8181
‑
5G)、半纤维素酶(Solarbio：9025
‑
56
‑
3)、甘露醇(翌圣：60327ES76)、MES(Sigma：M3671
‑
50G)、KCl(Sigma&P9541
‑
500G)、CaCl2(Sigma： 93639
‑
100G)、BSA(MACS，130091376)。
[0014]本专利技术还提供了所述酶解液在单细胞转录组测序中的应用。
[0015]现有技术常用的叶片酶解液无法制备符合单细胞测序样本要求的艾草原生质体悬液，表现为活率低于30％、得率极低。本专利技术提供的一种适用于单细胞测序的艾草叶片原生质体制备方法中使用的酶解液A通过本专利技术中所描述的实验步骤可以分离得到活率大于85％、碎片率低于10％、结团率低于4％且得率很高的原生质体悬液。
[0016]本专利技术还提供了一种艾草叶片组织原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0017]步骤1、配置酶解液：分别配置酶解液A和YF缓冲液，并置于离心管中室温放置备用；
[0018]步骤2、样本预处理：将艾草叶片用无菌水冲洗后，切成细丝后放入盛有所述酶解液A 的培养皿中；
[0019]步骤3、酶解：将装有酶解液A和组织的培养皿置于恒温混匀仪后酶解，避光消化，吸取酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数；
[0020]步骤4、过滤：将步骤3中的消化液用组装在离心管上的细胞筛网过滤；
[0021]步骤5、离心：将过滤液用水平转子离心，富集原生质体，弃去部分上清液，重悬沉淀，镜检计算原生质体总数；
[0022]步骤6、洗涤原生质体沉淀：用室温的YF缓冲液富集原生质体1
‑
2次，弃去上清液后，用YF缓冲液重悬原生质体，得到所述艾草叶片组织原生质体。
[0023]其中，所述艾草叶片组织原生质体的纯度高：碎片率由35％降低至4％以下、得率由相同鲜重的组织由2100个提升至1
×
106个、活性由27％提升至90％。
[0024]本专利技术所述步骤6后还包括步骤7镜检原生质体活性：通过台盼蓝染色，显微镜下镜检计算存活原生质体比例、原生质体结团比例、碎片比例和原生质体浓度。
[0025]在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：
[0026]步骤1、配置酶解液
[0027]步骤1.1、依照各自配方，分别配置酶解液A、YF缓冲液。
[0028]步骤1.2、配置完成后的酶解液A、YF溶液经过0.22μm滤膜过滤后分别置于50mL离心管中于室温放置备用。
[0029]其中，所述酶解液A和YF缓冲液分别使用，YF缓冲液的作用为洗涤原生质体并作为上机油包水缓冲液。
[0030]步骤2、样本预处理
[0031]步骤2.1、将艾草叶片从植株上取下，使用无菌水冲洗去除表面灰尘。
[0032]步骤2.2、将厨房用纸对折或滤纸平铺在20cm
×
20cm方皿中展平，湿水。
[0033]步骤2.3、将组织置于展平的厨房用纸或滤纸上，在镊子辅助下使用刀片将组织切成 0.5mm的细丝后转移至盛有5mL酶解液的35mm直径的培养皿中。
[0034]步骤2.4、每5mL酶解液A对应组织鲜重0.5(
±
0.01)g。
[0035]步骤3、酶解
[0036]步骤3.1、将装有酶解液A和组织的培养皿置于恒温混匀仪进行酶解4h，避光消本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液。2.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R
‑
10、0.4％(m/v)离析酶R
‑
10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM 2
‑
(N
‑
吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、10mM CaCl2、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中。3.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述YF溶液中含有20mM 2
‑
(N
‑
吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP
‑
40，溶于超纯水中。4.一种艾草叶片组织原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤1、配置酶解液：分别配置酶解液A和YF缓冲液，并置于离心管中室温放置备用；步骤2、样本预处理：将艾草叶片用无菌水冲洗后，切成细丝后放入盛有所述酶解液A的培养皿中；步骤3、酶解：将装有酶解液A和组织的培养皿置于恒温混匀仪后酶解，避光消化，吸取酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数；步骤4、过滤：将所述步骤3中的消化液用组装在离心管上的细胞筛网过滤；步骤5、离心：将过滤液用水平转子离心，富集原生质体，弃去部分上清液，重悬沉淀，镜检计算原生质体总数；步骤6、洗涤原生质体沉淀：用室温的YF缓冲液富集原生质体1
‑
2次，弃去上清液后，用YF缓冲液重悬原生质体，得到所述的艾草叶片组织原生质体。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述室温为20～25℃；和/或，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R
‑
10、0.4％(m/v)离析酶R
‑
10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：范黎明，朱燕敏，王佳琦，殷昊，李想，佟思雨，刘宇华，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：