一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用。本发明专利技术的动物模型构建方法，以NLRP3基因敲除动物(NLRP3

【技术实现步骤摘要】
一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪肝(non
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alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以无过量饮酒史和其他明确损肝因素导致的慢性肝脏脂质代谢综合征，是胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱等多种因素导致的肝脏损伤。NAFLD早期的病理形式为单纯的肝脂肪变性，随着病程的发展以及非酒精性脂肪肝炎(non
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alcoholic steatohepatitis,NASH)参与，逐步发展为肝纤维化和肝硬化，最终导致肝衰竭。根据流行病学调查发现，西方国家正常人群NAFLD的患病率约为20％
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40％。随着我国经济的迅速发展，人们生活的习惯和饮食结构发生改变，NAFLD在我国的发病情况也不容小觑。目前，我国NAFLD的患病率从20世纪90年代的12.9％升高至21.2％，其中10％
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20％的NAFLD患者进展为NASH，资料显示，NAFLD已成为我国继病毒性肝炎之后第二大慢性疾病，成为威胁人类健康的严重问题。
[0003]选择有效合适的动物模型是研究NAFLD的实验基础。目前，用于构建非酒精性脂肪肝模型的动物基本采用大鼠、小鼠、兔、斑马鱼和小型猪等，不同的模型动物在构建非酒精性脂肪肝各有其优缺点。兔与人类的胆固醇代谢不完全一致，病变部位与人类也不尽相同，且容易继发感染而死亡；斑马鱼虽然易于活体观察病变，但其在进化上与人类甚远，而且发育早期细胞的家系很难确定；小型猪与人在解剖学和疾病发生机理方面有很大相似性，但其体型较大，饲养管理与实验操作困难，难以获得足够的样本量；大鼠和小鼠模型体积较小，繁殖力强，易于大规模饲养，而且可以获得大量的样本量，是NAFLD模型常用的实验动物，具有多方面优势。
[0004]目前，常用的方法有营养性脂肪肝模型、药物中毒性脂肪肝模型和基因敲除或突变诱发模型，不同的造模方法所构建的NAFLD动物模型的形成机制以及病理改变也不同，各有其优点和缺陷。营养性脂肪肝模型与人类NAFLD的致病机制相似，而且具有渐进性发展的特点，该方法的缺点是建模时间长，造模周期一般在2
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3个月；药物中毒性脂肪肝模型虽然建模时间短、病变明显，但其发病机制、肝脏的病理改变与人类NAFLD差异较大，且药物毒性强，导致造模动物死亡率高；基因敲除或基因突变性模型能自发形成脂肪肝，且伴有脂肪代谢紊乱等代谢综合征，能够从整体水平、组织器官水平以及细胞和分子水平揭示非酒精性脂肪肝的发生发展机制。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用，本专利技术的构建方法以NLRP3基因敲除动物(NLRP3
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)为模型动物，通过高脂高果糖饮食构建非酒精性脂肪肝模型，通过连续监测不同时期NAFLD模
型实验动物的多项指标，模拟出NAFLD的病程，为NAFLD的发病机制、治疗药物的筛选和评价等方面提供理论依据。
[0006]一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007](1)将野生实验动物和NLRP3基因敲除实验动物适应性饲养后分别分为对照组Ⅰ和实验组Ⅰ，以及对照组Ⅱ和实验组Ⅱ；
[0008](2)给予实验组Ⅰ和实验组Ⅱ实验动物高脂饲料和果糖饮水，对照组Ⅰ和对照组Ⅱ实验动物基础饲料和饮用水，分别进行饲养造模；
[0009]在造模过程中，对实验动物每周称重，并进行油红O染色检测和TUNNEL检测，判断造模是否成功。
[0010]作为优选，实验动物的适应性饲养时间为4～7天。进一步优选为5天。
[0011]作为优选，实验动物的饲养条件为：饲养在动物屏障中心，室内温度18℃
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26℃，相对湿度50％
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70％，明暗循环12h/d，自由饮食和饮水，动物笼盒、玉米芯垫料及饲料、饮用水均经过高温高压消毒灭菌处理，每周更换3次动物垫料，每天补充饲料和饮用水。其中饮食可根据需要提供，如适应性饲养和对比组实验动物饲养为基础饲料，造模实验组实验动物为高脂饲料。
[0012]作为优选，将野生实验动物和NLRP3基因敲除实验动物分别进行实验组和对照组分组时，采用随机的方式进行。
[0013]作为优选，所述高脂饲料的配方以总量为100％计，包括：0.3～0.7％丙基硫氧嘧啶、1～3％胆固醇、0.5～1.5％胆盐，3～8％果糖、8～13％猪油、2～7％蛋黄粉和70～80％基础饲料；
[0014]所述果糖饮水的浓度为20～30％。
[0015]作为进一步优选，所述高脂饲料的配方以总量为100％计，包括：0.5％丙基硫氧嘧啶、2％胆固醇、1％胆盐，5％果糖、10％猪油、5％蛋黄粉和76.5％基础饲料；
[0016]所述果糖饮水的浓度为25％。
[0017]作为优选，所述实验动物为大鼠或小鼠。
[0018]作为优选，所述NLRP3基因敲除实验动物为纯合子(NLRP3
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)雄性小鼠，体重为19～21g，品系为C57/BL6，SPF级；
[0019]所述野生实验动物为雄性小鼠，品系为C57/BL6。
[0020]作为优选，步骤(2)中，进行油红O染色检测和TUNNEL检测的同时，检测造模后的实验动物的血清生化指标和MDA含量。
[0021]作为进一步优选，所述血清生化指标包括ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、TG(甘油三酯)和TC(总胆固醇)含量。
[0022]作为进一步优选，通过检测实验动物血清生化指标和MDA(丙二醛)含量，判定造模成功与否的标准为：
[0023]血清中ALT、AST、TG、TC含量以及肝组织MDA指标高于正常水平2倍判定为轻度NAFLD，高于正常水平3倍为中度NAFLD。
[0024]作为优选，对实验动物进行油红O染色检测和TUNNEL检测包括两个阶段：
[0025]第一阶段为在6～10周时，对部分实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的实验动物进行油红O染色检测和TUNNEL检测；进行第一阶段检测后，根据油红O染色检测和TUNNEL检测的检测结果，
对是否造模成功进行判断，并对造模成功的情况，进行如下第二阶段的检测；
[0026]第二阶段为在18～23周时，对剩余实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的实验动物、对照组Ⅰ和实验组Ⅰ的实验动物分别进行油红O染色检测和TUNNEL检测。
[0027]作为进一步优选，在造模第8周末处理部分实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的实验动物，第20周末处理对剩余实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的实验动物、对照组Ⅰ和实验组Ⅰ的实验动物；
[0028]所述处理为：将实验动物禁本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将野生实验动物和NLRP3基因敲除实验动物适应性饲养后分别分为对照组Ⅰ和实验组Ⅰ，以及对照组Ⅱ和实验组Ⅱ；(2)给予实验组Ⅰ和实验组Ⅱ实验动物高脂饲料和果糖饮水，对照组Ⅰ和对照组Ⅱ实验动物基础饲料和饮用水，分别进行饲养造模；在造模过程中，对实验动物每周称重，并进行油红O染色检测和TUNNEL检测，判断造模是否成功。2.根据权利要求1所述的基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，所述高脂饲料的配方以总量为100％计，包括：0.3～0.7％丙基硫氧嘧啶、1～3％胆固醇、0.5～1.5％胆盐，3～8％果糖、8～13％猪油、2～7％蛋黄粉和70～80％基础饲料；所述果糖饮水的浓度为20～30％。3.根据权利要求1所述的基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，所述实验动物为大鼠或小鼠。4.根据权利要求1所述的基于NLRP3基因敲除的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，所述NLRP3基因敲除实验动物为纯合子雄性小鼠，体重为19～21g，品系为C57/BL6，SPF级；所述野生实验...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄劲松，刘寿荣，席建军，邵益丹，邹玺，史婷婷，庄让笑，潘金明，琚立萍，姜晓杰，
申请(专利权)人：杭州市西溪医院，
类型：发明
国别省市：