一种人乙酰化多肽、抗原及其抗体制造技术

本申请涉及一种人乙酰化多肽及其特异性识别所述人乙酰化多肽的抗体。所述抗体已被证实能够特异性地结合人乙酰化Parkin，可广泛应用于蛋白免疫印迹分析、免疫荧光分析和免疫组化分析等不同实验。本申请也将为开发人乙酰化Parkin作为肿瘤分子标志物用于宫颈癌早期诊断及判断宫颈癌患者预后打下基础。断及判断宫颈癌患者预后打下基础。断及判断宫颈癌患者预后打下基础。

【技术实现步骤摘要】
一种人乙酰化多肽、抗原及其抗体


[0001]本申请属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种人乙酰化多肽、抗原、抗体及其在人乙酰化Parkin水平的检测中的应用。具体地，本申请涉及一种抗人乙酰化Parkin的抗体。

技术介绍

[0002]宫颈癌属于妇科常见恶性肿瘤之一，其死亡率在所有女性恶性肿瘤中位居第四。2018年，全世界宫颈癌新发病例数569847，死亡人数高达311365，严重危害女性生命健康安全。在我国，2015年最新统计数据显示，宫颈癌每年新发病例大约有9.39万，死亡病例3.05万。随着社会发展进步，人们生活习惯改变，生活环境改变等，宫颈癌发病率呈年轻化趋向，且发病率呈持续性上升发展趋势。研究发现宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染密不可分。此外，还有许多与宫颈癌发生密切相关的危险因素，如多产史、多次人工流产史、多个性伴侣、吸烟等。宫颈癌起源于宫颈鳞状
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柱状交界处，可涉及外部的鳞状细胞，内部的腺细胞，或两者兼而有之。它的癌前病变表现为异常增生，即宫颈上皮内瘤变(CIN)或原位腺癌，可发展为侵袭性癌，但这个过程可能非常缓慢。研究表明，在未经治疗的原位宫颈癌中，有30％至70％的患者将在10至12年内发展为浸润性癌，但也有10％的患者可以在不到1年的时间内从原位癌发展为侵袭性癌。目前，宫颈癌最有效的治疗方式仍为手术治疗，其它辅助治疗包括放疗、化疗等，可明显改善患者预后。但是晚期患者往往错失手术治疗时机，而大多术后患者仍存在较高的复发以及远处转移的风险，加之化疗、放疗引起的毒副反应大，患者耐受性差，从而影响疗效。因此，深入研究宫颈癌发生的分子机制，并开发相应的靶向治疗药物，成为当前晚期宫颈癌治疗亟需解决的重要问题。
[0003]新近研究发现，宫颈癌发生与表观遗传学改变密切相关。表观遗传是指不通过DNA序列改变就能影响基因表达的、可遗传的调控方式，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。在宫颈癌组织中，HDAC1/2、SIRT1/2/7等HDACs异常高表达，增加组蛋白去乙酰化，通过恢复组蛋白正电荷而增加DNA与组蛋白之间的引力,使松弛的核小体变得十分紧密，导致抑癌基因低表达。由于这些异常表达的HDACs与患者预后、药物耐药密切相关，因而成为宫颈癌治疗的新靶点。针对宫颈癌组织中异常表达的HDACs，本申请的专利技术人之前使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)进行抗肿瘤治疗，如SAHA、TSA等，结果显示HDACIs显著抑制人宫颈癌细胞生长，进一步实验发现HDACIs处理的人宫颈癌细胞中，线粒体膜电位下降，线粒体膜蛋白如TOMM20、TIM23水平降低，自噬相关蛋白如LC3、P62等更多地聚集在线粒体内，电镜分析发现大量线粒体自噬泡形成，提示线粒体自噬可能与HDACIs抗宫颈癌有关。
[0004]线粒体自噬，是指在R0S、营养缺乏、细胞衰老、肿瘤等的刺激下，细胞内的线粒体发生去极化损伤，线粒体电势下降,受损伤的线粒体则被特异性的包裹到自噬体中，形成线粒体自噬泡(早期阶段)，后者与溶酶体融合使得受损的线粒体降解(晚期阶段)，进而维持细胞内线粒体稳定的特异性细胞自噬。线粒体自噬与肿瘤发生的关系极为密切。研究表明，
线粒体自噬对肿瘤起着双向调节作用。一方面，细胞通过线粒体自噬可以及时清除受损线粒体而维持内环境稳定，一定程度上抑制了细胞的恶性转化，线粒体自噬缺陷导致肿瘤发生。比如，线粒体自噬相关蛋白BNIP3突变引起线粒体功能缺陷，细胞内糖酵解水平增高、ROS产生增多，导致更多的线粒体受损并在细胞内聚集，最终促使肿瘤发生。相反，增加线粒体自噬水平引起肿瘤细胞死亡，增强抗肿瘤药物杀伤作用。另一方面，在恶劣的肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过线粒体自噬及时清除受损的线粒体、减少ROS产生，一定程度上缓解了细胞的氧化应激，保护细胞存活。比如，在宫颈癌组织中，线粒体外膜蛋白FUNDC1异常高表达，提示患者预后较差。本申请的专利技术人之前在宫颈癌研究中也已发现，线粒体自噬水平影响抗肿瘤药物的药效。因此，研究线粒体自噬有助于揭示宫颈癌发生的分子机制，对治疗宫颈癌意义重大。
[0005]机制上，介导细胞线粒体自噬的通路主要包括Parkin依赖的途径，即PINK1
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Parkin信号通路，以及Parkin非依赖的途径，如线粒体外膜蛋白FUNDC1通过模体与自噬特征蛋白LC3结合进而参与乏氧介导的线粒体自噬。PINK1是一种线粒体蛋白激酶，胞浆内合成的PINK1前体通过外膜TOMM复合体和内膜TIMM复合体被转运至内膜,并先后被内膜定位的蛋白酶MPP和PARL切割，切割后的PINK1重新回到胞浆中,在泛素连接酶UBRs的共同作用下，通过蛋白酶体途径降解。Parkin蛋白是由抑癌基因PARK2编码的RING finger家族E3泛素连接酶，多数情况下存在于胞浆。在许多肿瘤中，PARK2基因发生突变，包括宫颈癌等，突变位点位于人染色体6q25
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27，多发生在PARK2基因编码区，表现为基因杂合子丢失、DNA拷贝数减少、启动子区域DNA甲基化等，这些突变损伤Parkin蛋白的E3泛素连接酶活性，导致其抑癌功能丧失。线粒体自噬过程中，线粒体外膜上的蛋白激酶PINK1通过与E3泛素连接酶Parkin相互作用，即ubiquitin phosphorylation(p
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Ser65
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Ub)，将其募集到线粒体表面，促进线粒体外膜蛋白分子泛素化，进而被自噬接头蛋白P62识别并被募集到自噬泡中，启动线粒体自噬。与此同时，本申请的专利技术人在之前的研究中发现了一种新的负性调控Parkin蛋白的机制，即PTEN蛋白分子的异构体PTEN
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L，位于线粒体外膜上，通过引起p
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Ser65
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Ub去磷酸化而削弱Parkin蛋白的E3连接酶活性，抑制线粒体自噬发生，进一步完善了线粒体自噬调控的机制。
[0006]除磷酸化修饰外，乙酰化修饰在线粒体自噬过程中也发挥重要作用。乙酰化是指将乙酰基转移到氨基酸侧链基团上的过程，也是一种常见的蛋白翻译后修饰方式。新近研究提示线粒体蛋白乙酰化水平与线粒体自噬、线粒体自噬相关疾病关系密切相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病等，比如乙酰化酶GCN5L1、NatA,，分别在哺乳动物、酵母细胞内调控线粒体自噬。许多组蛋白去乙酰化酶，包括HDAC6、SIRT3/4/5等，通过去乙酰化并活化FOXO3转录功能，或直接引起线粒体自噬调控的关键分子PINK1去乙酰化，诱导线粒体自噬。但也有研究报道蛋白乙酰化比如HSP70参与线粒体自噬过程，而抑制SIRT1则促使Parkin向线粒体转位并诱导线粒体自噬，提示Parkin乙酰化可能调控线粒体自噬的分子机制，但相关的作用机制并不明确。

技术实现思路

[0007]为进一步明确细胞线粒体自噬发生的分子机制，本申请围绕Parkin蛋白乙酰化修饰做了全面深入地研究，利用蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乙酰化多肽，其特征在于，所述人乙酰化多肽包括多肽序列HTDSRK(acetyl)DSPPAGSPA中含有乙酰化氨基酸残基K(acetyl)的至少6个连续的氨基酸残基。2.如权利要求1所述的人乙酰化多肽，其特征在于，所述人乙酰化多肽的序列为HTDSRK(acetyl)DSPPAGSPA。3.一种人乙酰化多肽，其特征在于，所述人乙酰化多肽的序列包括HTDSRK(acetyl)DSPPAGSPA。4.一种抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1
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3之一的人乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。5.如权利要求4所述的抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自BSA、KLH、OVA或BTG。6.一种抗体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙馨，张建宾，高瑞兰，叶桂琴，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：