载体肽片段及其利用制造技术

根据本发明专利技术，提供一种高效地将目标外来物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的技术。这里所公开的在体外或体内将目标外来物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的方法包括：(1)准备外来物质导入用构建体的工序，上述外来物质导入用构建体具有由KKRTLRKSNRKKR(序列号1)构成的载体肽片段和与该载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的上述目标外来物质；(2)将上述外来物质导入用构建体供给到包含目标真核细胞的样品中的工序；和(3)对供给了上述外来物质导入用构建体的上述样品进行孵育，向该样品中的真核细胞内导入上述构建体的工序。胞内导入上述构建体的工序。胞内导入上述构建体的工序。

【技术实现步骤摘要】
载体肽片段及其利用


[0001]本专利技术涉及一种将外来物质从真核细胞的外部向该细胞的内部导入(移送)的方法和用于该方法的载体肽片段。

技术介绍

[0002]目前，向人或人以外的哺乳动物等的细胞(真核细胞)内导入多肽等外来物质，尤其是生理活性物质，改变该细胞(进而由该细胞构成的组织或器官)的性状，或者改善、提高该细胞的功能。
[0003]例如，在专利文献1中公开了一种用于将多肽、DNA等外来物质导入细胞内的细胞透过性载体肽。在该专利文献中记载了通过使用将细胞透过性载体肽和异源多肽、DNA等连结而成的载体肽缀合物(carrier peptide conjugate)，能够将多肽、DNA等生理活性物质高效地导入细胞内。
[0004]另外，寻求一种方法，其能够不使用特别的装置而将分子量较大的多肽整体作为想要导入的外来物质(生理活性物质)容易地导入目标细胞内，改变该细胞的性状、或者改善(或提高)功能。
[0005]再或者，寻求一种方法，其能够代替导入多肽或蛋白质整体，而着眼于该多肽具有的某特定的功能，将作为可表达该功能的最小单位的氨基酸序列部分、即构成肽基序(肽片段)的氨基酸序列(外来物质)高效地导入细胞内。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：日本专利第3854995号公报
[0009]专利文献2：国际公开第2011/013700号
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1：生物化学期刊(JOUNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)，281卷35号，2006年，pp.25223
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25230

技术实现思路

[0012]专利技术所要解决的课题
[0013]在专利文献2中公开了一种外来物质导入用构建体，其包含非专利文献1所记载的作为核仁定位信号(Nucleolar localization signal：以下称为“NoLS”。)已知的序列号2记载的氨基酸序列(载体肽片段)和目标外来物质。该构建体由于能够高效地通过真核细胞的细胞膜，从而能够高效地将上述目标外来物质从真核细胞的外部向该细胞的细胞质内导入。
[0014]近年来，从医疗等观点考虑，对上述的以NoLS为首的细胞膜透过性肽的关注提高，期望更高效地将外来物质导入目标细胞的技术的开发。
[0015]因此，本专利技术是为了应对该期望而作出的，其目的在于提供一种能够高效地将目
标外来物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的方法。另外，本专利技术的目的在于提供一种构建体，其能够高效地将目标外来物质从真核细胞的外部导入该细胞的细胞质内，该构建体具有载体肽片段和该外来物质。
[0016]用于解决课题的方法
[0017]本专利技术的专利技术人为了更高效地将上述的专利文献2所公开的外来物质导入用构建体从真核细胞的外部向该细胞的细胞质导入，对序列号2所示的氨基酸序列进行了各种各样的氨基酸残基的取代，尝试了细胞膜透过性更高的构建体的制作。其结果发现，在将从序列号2所示的氨基酸序列的N末端侧开始数第8个天冬酰胺用丝氨酸取代且将第9个天冬酰胺酸取代为天冬酰胺而得到的突变体中，细胞膜透过性提高。出人意料的是，上述第9个氨基酸残基的取代并不是氨基酸残基的保守取代的所谓保守性取代(例如将碱性氨基酸残基用另外的碱性氨基酸残基取代得到的序列)。即，这里所公开的序列号1记载的氨基酸序列是本专利技术的专利技术人通过大量的试错而得到的。
[0018]这里所公开的方法是将目标外来物质从真核细胞(特别是以不具有细胞壁的人或其以外的哺乳动物为代表的各种动物细胞)的外部(即细胞膜的外侧)至少向该细胞的细胞质内(优选进一步向核内)导入(移送)的方法。即，这里所公开的外来物质导入方法包括：
[0019](1)准备外来物质导入用构建体的工序，上述外来物质导入用构建体具有：
[0020]由以下的氨基酸序列构成的载体肽片段，
[0021]KKRTLRKSNRKKR(序列号1)；和
[0022]与上述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的上述目标外来物质；
[0023](2)将上述外来物质导入用构建体提供给包含目标真核细胞的样品中的工序；
[0024](3)对供给了上述外来物质导入用构建体的所述样品进行孵育，向该样品中的真核细胞内导入上述外来物质导入用构建体的工序。
[0025]这里，“外来物质”是指能够与上述载体肽片段的N末端侧或C末端侧直接结合或经由适当的接头间接结合的无机化合物和有机化合物，且具有能够导入真核细胞内的分子尺寸和化学性质。
[0026]根据上述结构的外来物质导入方法，通过将使目标外来物质(典型地为多肽、核酸、色素、药剂等有机化合物)与上述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧直接结合或经由适当的接头间接结合而构建的外来物质导入用构建体提供到包含目标真核细胞的样品(例如，包含该细胞的培养物)中(即在生存的真核细胞中添加)，能够使该目标外来物质从真核细胞的外部(细胞膜的外侧)通过细胞膜，高效地导入细胞质内(优选进一步通过核膜而导入核内)。
[0027]这里所公开的外来物质导入方法的优选的一个方式中，特征在于，上述外来物质是选自多肽、核酸、色素和药剂中的任一种有机化合物。以包含这样的有机化合物方式制得的构建体能够更高效地向目标细胞内导入。
[0028]这里，“多肽”是指具有多个氨基酸通过肽键键合而成的结构的聚合物。多肽的肽键的数量(即，氨基酸残基数)不受限定。即，多肽包括氨基酸残基数为10以上且低于300的程度的一般被称为肽的物质和一般被称为蛋白质(典型地为由300以上的氨基酸残基构成的高分子化合物)的物质。在该领域中，多肽和蛋白质未被严格区分。在本说明书中，将由多个氨基酸残基构成的聚合物(包括寡聚物。)总称为多肽。
[0029]另外，“核酸”是指核苷酸的聚合物，包含DNA和RNA。“核酸”的碱基数不受限定。
[0030]另外，这里所公开的外来物质导入方法的优选的另一个方式中，上述外来物质是源自任意生物种的成熟多肽或其前体多肽，上述外来物质导入用构建体是具有与作为该外来物质的成熟多肽或其前体多肽对应的氨基酸序列和上述载体肽片段的氨基酸序列的合成多肽。
[0031]根据该结构，能够将具有上述成熟多肽或其前体多肽的氨基酸序列和载体肽片段的氨基酸序列的合成肽高效地向目标真核细胞内导入。
[0032]另外，这里所公开的外来物质导入方法的优选的另一个方式中，与作为上述外来物质的成熟多肽或其前体多肽对应的氨基酸序列配置于上述载体肽片段的N末端侧。
[0033]根据该结构，能够更高效地将上述成熟多肽或其前体多肽的氨基酸序列向目标真核细胞内导入。
[0034]另外，这里所公开的外来物质导入方法的优选的另一个方式中，导入上述外来物质导入用构建体的对象的真核细胞是人或人以外的哺乳动物的细胞。
[0035]根据这里所公开的方法，能够高效地将外来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在体外或体内将目标外来物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的方法，其特征在于，包括：(1)准备外来物质导入用构建体的工序，所述外来物质导入用构建体具有：由以下的氨基酸序列构成的载体肽片段，KKRTLRKSNRKKR(序列号1)；和与所述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的所述目标外来物质；(2)将所述外来物质导入用构建体供给到包含目标真核细胞的样品中的工序；和(3)对供给了所述外来物质导入用构建体的所述样品进行孵育，向该样品中的真核细胞内导入所述外来物质导入用构建体的工序。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外来物质是选自多肽、核酸、色素和药剂中的任一种有机化合物。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外来物质是源自任意生物种的成熟多肽或其前体多肽，所述外来物质导入用构建体是具有与作为该外来物质的成熟多肽或其前体多肽对应的氨基酸序列和所述载体肽片段的氨基酸序列的合成多肽。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：与作为所述外来物质的成熟多肽或其前体多肽对应的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝利小林菜穗子，吉田彻彦，
申请(专利权)人：东亚合成株式会社，
类型：发明
国别省市：