一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法技术

本发明专利技术涉及筛选人类LncROR基因技术领域，具体地说就是一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法。一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法，其核苷酸序列如IDNO.1～3所示，所述引组物用于筛选人类血清外泌体中都含有的长链非编码RNALncROR基因含量阈值多态性。一种筛选人类LncROR基因含量多态性的检测方法，包括上述引物组，核苷酸序列为IDNO.1～3所示的引组物，以检测时间15或20min的检测线测定需求阈值。本申请方法将试剂盒中肽核酸(PNA)预先与样本DNA结合，然后利用重组酶聚合酶扩增(RPA)极为快速的扩增技术，并结合等位基因特异性扩增(ASA)在15min和20min(样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出LncROR1基因含量多态性。出LncROR1基因含量多态性。出LncROR1基因含量多态性。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法


[0001]本专利技术涉及筛选人类LncROR基因
，具体地说就是一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法。

技术介绍

[0002]快速、准确并且简便的基因多态性筛查方法一直受到广泛的重视。人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，也决定了目前基因组测定是有意义的，即有代表性的。
[0003]长链非编码RNA(Longnon
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codingRNA，LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明，LncRNA在剂量补偿效应(Dosagecompensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。
[0004]其中，LncROR1被认为是个非常有潜力的靶点，因为它作为酪氨酸激酶受体，具有可药性；其次，它在细胞表面表达；更重要的是，它在肿瘤细胞中高度表达，而在成人健康组织中表达量很低。目前有多家公司在开发靶向ROR1的抗癌疗法，其中包括单克隆抗体、抗体偶联药物(ADC)、双特异性抗体、以及CAR
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T疗法等多种治疗模式。到目前为止，基于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA的测序技术已成为一个标准技术，然而，由于该标准技术需要大型的设备和复杂的实验步骤，包括热循环设备和DNA测序设备等，目前的分子筛选方法仍然大大阻碍该基因多态性检测的效果。

技术实现思路

[0005]为解决上述LncROR1检测方法需要大型设备并且操作复杂的问题，本专利技术提供了一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法，其核苷酸序列如IDNO.1～3所示，所述引组物用于筛选人类血清外泌体中都含有的长链非编码RNALncROR基因含量阈值多态性。
[0007]一种筛选人类LncROR基因含量多态性的检测方法，包括上述引物组，核苷酸序列为IDNO.1～3所示的引组物，以检测时间15或20min的检测线测定需求阈值。
[0008]作为优化，包括如下步骤：
[0009]S1.准备浓度分别为300ng/μL、200ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL的逆转录样本ctDNA各2μL；
[0010]S2.将11.5μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物IDNO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物IDNO.2、0.5μL的浓度为10μM的探针引物IDNO.3、步骤S1的逆转录样本ctDNA、和29.5μL重泡胀缓冲液依次加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀；
[0011]S3.向混匀后的步骤S2所得溶液中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液，混匀；
[0012]S4.步骤S3所得的混合溶液扩增20min；
[0013]S5.步骤S4扩增后的溶液按照每20μL产物加入到80μL的测试试纸条缓冲液静置1分钟，静置后插入试纸条检测。
[0014]作为优化，包括如下步骤：
[0015]S1.准备浓度分别为300ng/μL、200ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL的逆转录样本ctDNA各2μL；
[0016]S2.将11.5μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物IDNO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物IDNO.2、0.5μL的浓度为10μM的探针引物IDNO.3、步骤S1的逆转录样本ctDNA、和29.5μL重泡胀缓冲液依次加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀；
[0017]S3.向混匀后的步骤S2所得溶液中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液，混匀；
[0018]S4.步骤S3所得的混合溶液扩增15min；
[0019]S5.步骤S4扩增后的溶液按照每20μL产物加入到80μL的测试试纸条缓冲液静置1分钟，静置后插入试纸条检测。
[0020]作为优化，重组酶聚合酶扩增所用试剂与酶均来源于英国TwistDx商品试剂盒。
[0021]本方案的有益效果是，一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组及检测方法，具有以下有益之处：
[0022]本申请采用核苷酸序列如IDNO.1～3所示的引组物，将试剂盒中肽核酸(PNA)预先与引组物DNA结合，然后利用重组酶聚合酶扩增(RPA)极为快速的扩增技术，并结合等位基因特异性扩增(ASA)在15min和20min(样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出LncROR1基因含量多态性，且检测出的阈值极低；
[0023]发现RPA主要扩增酶gp32和Bsu无法区别含量低于0.0001ng/μL和0.01ng/μL的待测样本，即含量低于此值可排除LncROR基因含量超标的情况。
[0024]通过本申请的检测方法筛选血液标本时，以阳性质控DNA和阴性质控为对照品，白色背景为筛选环境，筛选血液样本中基因含量多态性情况，结果显示阳性质控DNA产生阳性条带并且阴性质控未显示阳性条带，因此本申请的引组物及检测方法能够对血液样本中LncROR1基因含量多态性进行快速检测，无需大型设备，并且操作简便，能够大大减少LncROR1基因含量多态性的检测时间和工作量，提高检测效率。
附图说明
[0025]附图1为本专利技术IDNO.1序列表示意图。
[0026]附图2为本专利技术IDNO.2序列表示意图。
[0027]附图3为本专利技术IDNO.3序列表示意图。
[0028]附图4表示筛选LncROR基因含量多态性检测结果，从左至右依次显示了阳性对照组(试剂盒自带)、阴性对照组(无样本DNA)、2μL的浓度分别为300ng/μL、200ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL的逆转录样本ctDNA测试结果，扩增时间为20min。
[0029]附图5表示筛选LncROR基因含量多态性检测结果，从左至右依次显示了阳性对照组(试剂盒自带)、阴性对照组(无样本DNA)、2μL的浓度分别为300ng/μL、200ng/μL、100ng/μ
L、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选人类LncROR基因含量多态性的引物组，其核苷酸序列如IDNO.1～3所示，所述引组物用于筛选人类血清外泌体中都含有的长链非编码RNALncROR基因含量阈值多态性。2.一种筛选人类LncROR基因含量多态性的检测方法，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组，核苷酸序列为IDNO.1～3所示的引组物，以检测时间15或20min的检测线测定需求阈值。3.根据权利要求2所述的一种筛选人类LncROR基因含量多态性的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：S1.准备浓度分别为300ng/μL、200ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL的逆转录样本ctDNA各2μL；S2.将11.5μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物IDNO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物IDNO.2、0.5μL的浓度为10μM的探针引物IDNO.3、步骤S1的逆转录样本ctDNA、和29.5μL重泡胀缓冲液依次加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀；S3.向混匀后的步骤S2所得溶液中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液，混匀；S4.步骤S3所得的混合溶液扩增20min；S5.步骤S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘元斌，董召刚，肖珂，王梅燕，
申请(专利权)人：刘元斌，
类型：发明
国别省市：