一种BREA2基因检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种BREA2基因检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括BREA2核酸检测引物、内参引物；本发明专利技术提供了一种BREA2核酸丰度检测的试剂盒，灵敏性好，特异性强，在科学实验中具有良好的适应性和实用性，可用于随时检测细胞转移情况。本试剂盒提供2对检测引物，实施过程可随机选择任意一对引物。相比传统只使用1对检测引物大大减少结果的随机性，更具统计学意义，结果更加准确可靠；试剂盒内的检测引物具有很高的灵敏度，仅需少量样本即可完成筛查；本试剂盒可用于细胞转移状态的监测，结果客观有效，可将细胞转移状态转化为量化指标，便于统计研究。统计研究。

【技术实现步骤摘要】
一种BREA2基因检测试剂盒及其应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种检测BREA2核酸表达水平的试剂盒及其应用。
(二)
技术介绍

[0002]肿瘤转移几乎是引起所有实体瘤患者死亡的主要原因，乳腺癌通常在肺、脑、骨等远端器官形成继发性肿瘤。肿瘤细胞的转移过程受多步骤驱动，目前仍未充分理解肿瘤细胞的“进化”和转移的机制，这也是限制开发抗肿瘤转移药物的主要障碍之一。
[0003]肿瘤转移检测通常以细胞划痕、Transwell的方法进行。细胞划痕和Transwell方法通过量化的手段准确地反映细胞的转移状态，但其所需较多的的时间与实验材料成本也为研究人员带来了诸多不便。开发简单、高效、准确的检测方法已然成为实时检测细胞转移状态的当务之急，一种高效、便捷、准确的细胞转移检测手段将为研究人员进行细胞生物学研究提供强有力的支持。
[0004]分子标记是指细胞内可遗传可检测的核酸序列或蛋白质，已被广泛用于基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及疾病相关基因的诊断和分析等领域。分子标记检测兼具高灵敏度、高特异性、可量化的优点，且随着生物化学与分子生物学技术的发展，分子标记的使用也趋于简易化。因此，筛选合适的分子标记用于指示细胞的转移状态具有极高的应用前景与研究价值。
[0005]BREA2(LINC02878)，是一个在多种实验常用细胞及人体组织中广泛稳定表达的基因，其通过信号通路调控细胞的转移状态，BREA2的表达量与细胞转移状态呈强烈的正相关。以样品RNA为模板，选择BREA2检测引物与内参引物进行RT
‑
qPCR反应，按照2
ΔΔCq
计算相对丰度，该数值反映了实验细胞或组织中BREA2的转录活跃水平，即可判断细胞转移状态情况。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种BREA2基因的检测试剂盒及其应用，该试剂盒内包含了两对BREA2表达水平检测引物，一对GAPDH内参引物。该试剂盒可用于所培养细胞系转移状态检测，具有高特异性，稳定性，灵敏性的特征，具有极大的潜在应用价值。只需少量病例样本，按照所提供的方法进行检测，即可对临床乳腺癌的发生及预后效果诊断提供依据。该试剂盒为乳腺癌的术前精确诊断、预后准确评估乳腺癌的转移提供了新的高灵敏，高特异性的分子检测标志，具有很高临床应用价值。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种BREA2基因检测试剂盒，所述试剂盒包括BREA2核酸检测引物、内参引物；所述检测引物为BREA2 F#1/BREA2 R#1或BREA2 F#2/BREA2 R#2中的一组或两组：
[0009]BREA2 F#1：5
’‑
TTTGTGACGCTCTTGTGCAG
‑3’
；
[0010]BREA2 R#1：5
’‑
GATGAGGCCACCAAGAGCAA
‑3’
；
[0011]BREA2 F#2：5
’‑
AGATGCGGCGGATCATAAGG
‑3’
；
[0012]BREA2 R#2：5
’‑
AATCCTGCACAAGAGCGTCA
‑3’
；
[0013]内参引物GAPDH F：5
’‑
GACAGTCAGCCGCATCTTCT
‑3’
；GAPDH R：5
’‑
GCGCCCAATACGACCAAATC
‑3’
。
[0014]进一步，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应液，所述反应液优选iTaq
TM Universal SYBR Green Supermix(Bio
‑
RAD)。
[0015]进一步，所述试剂盒包含样本RNA提取试剂，优选TRIzol(Ambion)。
[0016]进一步，所述试剂盒包含RNA逆转录试剂，优选iScript
TM
gDNA Clear cDNA Synthesis Kit(Bio
‑
RAD)试剂盒。
[0017]本专利技术所述BREA2基因检测试剂盒组成为：检测引物、内参引物、样本RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、PCR反应液。
[0018]本专利技术还提供一种所述BREA2基因检测试剂盒在检测BREA2基因表达量中的应用，所述的应用为：首先提取样本RNA，逆转录为cDNA，采用检测引物和内参引物，以cDNA为模板，在PCR反应液中进行荧光定量PCR检测Ct值，根据内参基因GAPDH的Ct值，按照2
‑
ΔΔCt
计算方法得到样品中BREA2基因的表达量，与正常对照相比，若Ct值高，则BREA2基因低表达。
[0019]进一步，所述荧光定量PCR检测反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种BREA2核酸丰度检测的试剂盒，灵敏性好，特异性强，在科学实验中具有良好的适应性和实用性，可用于随时检测细胞转移情况。本试剂盒提供2对检测引物，实施过程可随机选择任意一对引物。相比传统只使用1对检测引物大大减少结果的随机性，更具统计学意义，结果更加准确可靠；试剂盒内的检测引物具有很高的灵敏度，仅需少量样本即可完成筛查；本试剂盒可用于细胞转移状态的监测，结果客观有效，可将细胞转移状态转化为量化指标，便于统计研究。
(四)附图说明
[0021]图1为BREA2核酸转录本检测引物的溶解曲线图，a代表BREA2
‑
F1/R1的溶解曲线，b代表BREA2
‑
F2/R2的溶解曲线。
[0022]图2为本试剂盒提供的引物检测野生型MDA
‑
MB
‑
231细胞株和BREA2敲低细胞株中BREA2相对表达量柱形图。
[0023]图3为在迁移实验和侵袭实验中采用本试剂盒提供的引物检测野生型MDA
‑
MB
‑
231细胞株和BREA2敲低细胞株的显微图(A)、细胞迁移数(B)和吸光值(C)。
[0024]图4为不同乳腺癌细胞中BREA2丰度表达量柱形图。
[0025]图5为本试剂盒提供的BREA2核酸探针检测肿瘤组织和正常组织中BREA2相对表达量。
(五)具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0027]实施例1、BREA2核酸转录本检测引物的选取与质量鉴定
[0028]首先搜索BREA2核酸转录本mRNA序列的NCBI数据库编码NR_015445.1(https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_015445.1)。基于该序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BREA2基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括BREA2核酸检测引物、内参引物；所述检测引物为BREA2 F#1/BREA2 R#1或BREA2 F#2/BREA2 R#2中的一组或两组：BREA2 F#1：5
’‑
TTTGTGACGCTCTTGTGCAG
‑3’
；BREA2 R#1：5
’‑
GATGAGGCCACCAAGAGCAA
‑3’
；BREA2 F#2：5
’‑
AGATGCGGCGGATCATAAGG
‑3’
；BREA2 R#2：5
’‑
AATCCTGCACAAGAGCGTCA
‑3’
；内参引物GAPDH F：5
’‑
GACAGTCAGCCGCATCTTCT
‑3’
；GAPD...

【专利技术属性】
技术研发人员：林爱福，张祯，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：