一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法。本发明专利技术通过设计特定的乳腺癌易感基因变异长片段PCR检测引物对，结合PCR反应和基因测序，实现了对乳腺癌易感基因变异的快速和低成本检测，检出率高达100%，特异性为100%，可以用于临床检测乳腺癌易感基因变异。床检测乳腺癌易感基因变异。床检测乳腺癌易感基因变异。

【技术实现步骤摘要】
一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的引物对，试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]从世界卫生组织国际癌症研究机构公布的2020年全球最新癌症负担数据来看，被称为"粉红杀手"的乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，成为全球第一大癌。在我国，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，每年有30余万女性被诊断出乳腺癌，在东部沿海地区及经济发达的大城市，乳腺癌发病率上升尤其明显；从发病年龄来看，我国乳腺癌发病年龄呈现年轻化，从20岁以后开始逐渐上升，45～50岁达到高值。因此，乳腺癌的高发病率已经严重威胁我国女性健康。随着精准医疗和靶向治疗的进展，人们发现对乳腺癌患者血液或组织进行乳腺癌易感基因（BRCA1和BRCA2）突变检测有助于患者的预后和治疗。但是，由于BRCA1/2基因序列较长，变异形式多样，变异位点分散遍布于2个基因的全长，所以，除了BRCA基因编码区发生变异之外，其内含子也会发生变异。换句话说，要获得BRCA基因体细胞突变的准确信息，对BRCA的检测必须同时覆盖编码区和相邻边界区，即尽可能获取完整的BRCA基因序列。但普通PCR只能扩增2
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3kb的片段，而对于5kb以上的长片段基因很难有效的扩增。因此，非常有必要开发一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的方法及试剂盒，可以快速简单、低成本的完成乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2变异的检测，有助于对乳腺癌易感基因相关的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的引物对，试剂盒及其应用。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种可以长片段PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的引物对，包括如下核酸序列：(1) 长片段扩增BRCA1的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID 18所示；(2) 长片段扩增BRCA2的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30，SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34和SEQ ID 35/SEQ ID 36所示；
ID 30, SEQ ID 32, SEQ ID 34, SEQ ID 36)，适量的合适模板DNA及去离子水。
[0009]作为又以优选，所述步骤(2)中，基因组DNA，质粒或病毒DNA或cDNA模板的量分别为50
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400纳克，10皮克
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30纳克及1
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5微升。
[0010]作为又以优选，所述步骤(2)中，长片段PCR的扩增程序为：在95摄氏度下预变性合适时间；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为25
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35；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
[0011]作为又以优选，所述步骤(2)中，所述基因组DNA，质粒或病毒DNA及 cDNA的预变性时间分别为3分钟，30秒及3分钟。
[0012]作为优选，所述步骤(4)中，DNA片段化/末端修复/dA尾添加反应体系的配制程序为：取步骤3中50纳克纯化的PCR扩增产物进行等摩尔混合，然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。
[0013]作为又以优选，所述步骤(4)中，DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置。
[0014]作为优选，所述步骤(4)中，接头连接反应的程序为：在DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应完成后的反应体系中，依次加入2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升Quick T4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，然后置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。最后将反应体系在4摄氏度进行放置。
[0015]作为优选，所述步骤(4)中，接头产物纯化反应的程序为：依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤对所述接头产物进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
[0016]作为优选，所述步骤(4)中，文库扩增反应的程序为：将纯化后的接头产物与25微升2
×
Super Canace
®ꢀ
II High
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Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。
[0017]作为又以优选，所述步骤(4)中，文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置。
[0018]作为优选，所述步骤(4)中，文库扩增产物纯化的程序为：将获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
[0019]本专利技术的积极效果如下：本专利技术提供了一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的试剂盒，可以促进乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的检测高效完成。此外，相比于国内已上市艾德生物（维汝健）的人类BRCA1基因和BRCA2基因突变检测试剂盒而言，本专利技术试剂盒的检测样本范围从外周血拓展到了新鲜组织样本，可以更有效地完成乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2变异的检测，有助于对乳腺癌易感基因相关的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持，同时可以为病患和医院带来临床检测收益。
附图说明
[0020]图1 实施例1中BRCA1和BRCA2扩增结果琼脂糖凝胶电泳图：M为DL 15000 DNA marker；1
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5分别对应引物池1
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5所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的方法，其特征在于：S1. 所述乳腺癌易感基因BRCA1长片段扩增的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID 18所示；S2. 所述乳腺癌易感基因BRCA2长片段扩增的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30，SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34和SEQ ID 35/SEQ ID 36所示；S3. 使用具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 5/SEQ ID 6, SEQ ID 15和SEQ ID 16的所示引物对混合物，或具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10和SEQ ID 11/SEQ ID 12的所示引物对混合物，或具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 13/SEQ ID 14和SEQ ID 17/SEQ ID 18的所示引物对混合物，检测乳腺癌易感基因BRCA1；S4. 使用具有S2所述核苷酸序列SEQ ID 19/ SEQ ID 20，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30, SEQ ID 31/SEQ ID 32和SEQ ID 35/SEQ ID 36的所示引物混合物，或具有S2所述核苷酸序列SEQ ID 21/SEQ ID 22, SEQ ID 25/SEQ ID 26和SEQ ID 33/SEQ ID 34的所示引物对混合物，检测乳腺癌易感基因BRCA2。2.一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2长片段扩增的引物对，长片段PCR扩增的缓冲液，长片段扩增酶，dNTP。3.一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取人外周血或新鲜组织基因组DNA； (2)以提取的人外周血或新鲜组织基因组DNA、质粒或病毒DNA及 cDNA为模板、权利要求1中的长片段扩增引物对、长片段PCR扩增缓冲液，长片段扩增酶，dNTP，进行乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2...

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，任永丽，邓贵，
申请(专利权)人：奥明杭州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：