猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法。所述二联亚单位疫苗的有效成分为猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白。本发明专利技术二联亚单位疫苗的制备方法简单，猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白产量大、纯度高，抗原免疫性强，可有效激活机体的免疫反应，对猪瘟和猪伪狂犬病起到理想的免疫保护作用。与单价疫苗相比，可以减少人工成本、减少疫苗接种次数(一针双防)，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应，且保护效果与单价疫苗相当，中和抗体结果优于单价疫苗。中和抗体结果优于单价疫苗。

【技术实现步骤摘要】
猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及兽用疫苗领域，具体地说，涉及一种猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]猪瘟(Clssical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性烈性高度接触性传染病，一年四季均可发生，以病畜高热、内脏器官严重出血和高死亡率为特征，CSF的爆发严重制约着养猪业的健康发展。
[0003]猪伪狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesbvirus，PRV)引起的、严重危害我国养猪业健康发展的重要传染病之一。该病毒属于疱疹毒科甲型疱疹病毒亚科的线性双链DNA病毒，目前已知病毒糖蛋白有11种，其中gG为分泌蛋白，其余10种糖蛋白均锚定于病毒囊膜，在病毒感染、穿膜、融合细胞等过程中行使功能。伪狂犬病的易感范围很广，新生仔猪多为致死性感染，与其他易感物种类似，多死于中枢神经系统疾病。成年猪感染该病多表现呼吸系统疾病，大多呈隐性感染，无明显症状。猪感染PRV后，自身的免疫系统受到损害，免疫力下降，因而更易继发其他疾病，如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等，给猪伪狂犬病防治增加难度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种免疫原性组合物，包含猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白。
[0006]本专利技术中，E2、gB和gD蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。
[0007]优选地，猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白、gD蛋白是利用哺乳动物细胞(如CHO细胞)表达系统制备得到的。
[0008]本专利技术的免疫原性组合物中E2、gB和gD蛋白的质量比为2:3:3～16:25:25。优选3:4:4。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗，包含所述免疫原性组合物和佐剂。
[0010]所述疫苗中猪瘟病毒E2蛋白的含量为20
‑
80μg/mL，猪伪狂犬病毒gB蛋白的含量为30
‑
125μg/mL，gD蛋白的含量为30
‑
125μg/mL。
[0011]优选地，所述疫苗中猪瘟病毒E2蛋白的含量为30μg/mL，猪伪狂犬病毒gB蛋白的含量为40μg/mL，gD蛋白的含量为40μg/mL。
[0012]所述佐剂可以是油佐剂，优选ISA 201VG。
[0013]所述免疫原性组合物与所述佐剂的质量比为1:1。
[0014]第三方面，本专利技术提供猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0015]1)用PBS溶液将猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白分别稀释成浓度为90μg/mL、120μg/mL、120μg/mL；
[0016]2)将E2蛋白溶液、gB蛋白溶液和gD蛋白溶液按体积比1:1:1混匀即为抗原液；将抗原液与佐剂ISA 201VG按质量比1:1配苗，在31
±
1℃条件下，以150
‑
350r/min搅拌30
‑
60分钟，乳化成水包油包水型疫苗。
[0017]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0018](一)本专利技术提供的猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗，其制备方法简单，猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白产量大、纯度高，抗原免疫性强，可有效激活机体的免疫反应，对猪瘟和猪伪狂犬病起到理想的免疫保护作用。
[0019](二)本专利技术提供的猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗，与单价疫苗相比，可以减少人工成本、减少疫苗接种次数(一针双防)，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应，保护效果与单价疫苗相当，且中和抗体结果明显优于单价疫苗。
具体实施方式
[0020]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1分别表达猪瘟E2、猪伪狂犬gB、gD蛋白的载体构建及免疫原性验证
[0021]1.表达猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB、gD蛋白细胞株的构建
[0022]1.1基因合成
[0023]1.1.1E2基因合成
[0024]参考国内外经典毒株和流行毒株E2基因，对其密码子进行优化，并在优化后的E2序列的N端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到了3条编码E2基因序列并合成，分别标记为E2
‑
1、E2
‑
2、E2
‑
3。
[0025]1.1.2gB基因合成
[0026]，从GenBank上选用经典毒株和当前流行毒株的gB基因作为研究对象，通过密码子优化和修饰，并在优化后的gB序列的N端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到了3条编码gB基因序列并合成，分别标记为gB
‑
1、gB
‑
2、gB
‑
3。
[0027]1.1.3gD基因合成
[0028]从GenBank上选用经典毒株和当前流行毒株的gD基因作为研究对象，通过密码子优化和修饰，并在优化后的gD序列的N端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到了3条编码gD基因序列并合成，分别标记为gD
‑
1、gD
‑
2、gD
‑
3。
[0029]2载体构建：采用常规重组质粒构建流程。
[0030]2.1细胞转染
[0031]参照LipofectamineTM3000产品使用说明书具体步骤如下。转染前一天，按细胞密度1.5
×
105个/ml，接种6孔板，每孔2.0ml，置于36℃
‑
38℃，含5％CO2细胞培养箱中孵育过夜；当细胞交汇度达到80％
‑
90％时开始转染；用OPTI
‑
MEM培养基中稀释阳性质粒，制备DNA预混液，然后添加Lipofectamine
TM
3000试剂(充分混匀)；用OPTI
‑
MEM培养基稀释Lipofectamine
TM
3000试剂(充分混匀)；将在每管已稀释的Lipofectamine
TM
3000试剂中加
入稀释的DNA(摩尔比1:1)，室温孵育10
‑
15分钟，然后逐滴均匀加入6孔板；36℃
‑
38℃，含5％CO2细胞培养箱中培养4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.免疫原性组合物，其特征在于，包含猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和gD蛋白；其中，E2、gB和gD蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白、gD蛋白是利用哺乳动物细胞表达系统制备得到的，所用哺乳动物细胞为CHO细胞。3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，E2、gB和gD蛋白的质量比为2:3:3～16:25:25。4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于，E2、gB和gD蛋白的质量比为3:4:4。5.猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗，其特征在于，包含权利要求1
‑
4任一项所述的免疫原性组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，师小潇，候凤，李俊辉，王遵宝，李晓梅，张超，
申请(专利权)人：天康制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：